裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化-USB迷|专注于互联网分享

2024年3月10日发(作者：翠启)

中国动物传染病学报

2022,30(2): 126-133Chinese Journal of Animal Infectious Diseases

·研究论文·

裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

孙潇

1,2

，张艳芳

1,2

，叶静

1,2

，曹胜波

1,2

，陈政

1,2

（1.华中农业大学动物医学院，武汉430070；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉430070）

摘要：

采用杆状病毒表达系统表达并纯化裂谷热病毒（RVFV）Gn蛋白，并对其反应原性进行鉴定。根据GenBank公布的Gn蛋白

的序列，选取其主要抗原区Gn1设计引物进行PCR扩增，将扩增产物克隆至pFastBac HTB载体，构建重组转移载体，并将其转化

DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，经SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋

白正确表达后，将重组杆状病毒感染High5细胞，大量表达重组蛋白，并用镍柱亲和层析法进行纯化，最终获得纯度较高的Gn1重

组蛋白。本研究为 RVF 新型疫苗研发及诊断试剂的研发提供了重要材料。

关键词：

裂谷热病毒；Gn1蛋白；重组杆状病毒；蛋白纯化

中图分类号：

S852.65

文献标志码：

文章编号：

1674-6422（2022）02-0126-08

Expression and Puriﬁ cation of Gn1 Protein of Rift Valley Fever Virus in

Baculovirus System

SUN Xiao

1,2

, ZHANG Yanfang

1,2

, YE Jing

1,2

, CAO Shengbo

1,2

, CHEN Zheng

1,2

(1. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Agricultural

Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract: To produce Gn protein of Rift Valley fever virus (RVFV) using Baculovirus expression system and study its reactivity, the

main antigen region Gn1 was selected to design primers for PCR ampliﬁ cation according to the Gn sequence published by GenBank. The

ampliﬁ ed products were cloned into pFastBac HTB vectors to construct recombinant transfer vectors and then transformed into DH10Bac

receptive cells for blue-white screening. The recombinant rods were transfected into Sf9 cells to obtain recombinant baculoviruses. The

recombinant baculoviruses were conﬁ rmed in SDS-PAGE and Western blot and used to infect High5 cells. The recombinant Gn1 protein

was produced in large quantity and puriﬁ ed by nickel column afﬁ nity chromatography. This study provided important materials for the

development of RVF vaccines and diagnostic reagents.

cation

Key words:

Rift valley fever virus; Gn1 protein; recombinant baculovirus; protein puriﬁ

收稿日期：

2019-09-26

基金项目：

“十三五”国家重点研发计划（2017YFD0501803，2016YFD0501102）

作者简介：

孙潇，男，硕士研究生，预防兽医学专业

通信作者：

陈政，E-mail：*******************.

第30卷第2期孙潇等：裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

127

裂谷热（rift valley fever, RVF）是由裂谷热病毒

（Rift valley fever virus, RVFV）感染引起的一种危

害严重的人兽共患传染病，可导致反刍动物的大量

死亡及人类的致命性出血热。RVFV属于布尼亚病毒

科（Bunyaviridae）白蛉热病毒属（

Phlebovirus

），

主要经蚊媒传播。裂谷热首次报道于1912年的肯

尼亚，其最初仅流行于非洲东部地区

[1]

，但1950年

之后，该病开始沿撒哈拉沙漠向周边国家蔓延

[2]

。

2000年，裂谷热疫情扩散至亚欧大陆，沙特阿拉伯

和也门相继暴发该病

[3]

。之后，裂谷热疫情流行至

西亚地区，并对周边的非流行国家造成严重威胁。

近年来，伴随进出口贸易的增加、国际交流的日益

频繁，裂谷热的流行区域已在全球范围逐步扩大。

2016年，我国确诊了首例输入性裂谷热病例，并引

发了社会的高度关注

[4]

。

裂谷热是世界动物卫生组织列定的A类传染

病，其宿主范围广，对畜牧业生产危害严重。牛、

山羊和绵阳是RVFV的最易感宿主，羔羊和犊牛感染

后的死亡率可高达90%，妊娠牛羊感染后胎儿死亡

率接近100%

[5]

。感染RVFV后的动物主要表现为精神

不振、厌食症、腹泻、流鼻血和黄疸等，并伴发肝

脏、胃、小肠等多器官的出血坏死

[6]

。人对RVFV也

易感，一般主要通过处理感染性材料接触或通过蚊

虫媒介叮咬而感染。患者一般表现为出血热并伴发

非特异性流感样症状。当患者出现严重肝脏损伤或

神经系统并发症时，死亡率可高达50%

[7]

。目前，裂

谷热尚无特定治疗方法，及早诊断及免疫预防是控

制该病最有效方法。

RVFV为单股分节段负链RNA病毒，由L、M、

S 3个节段组成，其中L节段编码核酸内切酶和RNA

依赖的RNA聚合酶；M节段主要编码前体囊膜糖蛋

白G；S节段主要编码核衣壳蛋白N及非结构蛋白

NSs

[8-9]

。RVFV囊膜蛋白G在翻译后修饰过程中裂解

为Gn蛋白和Gc蛋白，二者均为RVFV的主要抗原蛋

白，其中，Gn蛋白可诱导宿主产生中和抗体，因而

可作为研究RVF基因工程疫苗的重要靶蛋白

[10]

。本

研究选取Gn蛋白主要抗原区Gn1，利用杆状病毒表

达系统构建表达Gn1蛋白的重组杆状病毒，并在昆

虫细胞中表达和纯化Gn1蛋白，以期为RVF亚单位疫

苗及诊断试剂的研发提供重要材料。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒

Gn1质粒由生工生物工程（上海）

股份有限公司合成构建；转移载体pFastBac HTB

（HTB）、感受态细胞DH10Bac、Sf9、High5细胞

由本实验保存。

1.2 主要试剂

DNA聚合酶、DNA marker、

Bam

HⅠ

和

Eco

RⅠ限制性内切酶购自ABclonal公司；T4连接

酶购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒、质粒小提

试剂盒、蛋白marker购自天根生化科技(北京)有限

公司；Lipofectamine

3000、MTS购自Invitrogen公

司；Grace基础培养基（粉末）购自GIBCO公司；

Sf9无血清培养基购自HyClone公司。

1.3 引物设计与合成

RVFV

基因片段全长1610 bp，

不易进行表达和纯化。本研究根据RVFV M片段序

列（GenBank登录号：DQ380206）、G蛋白主要抗

原区的相关报道，并结合DNAStar软件分析Gn蛋白

的亲水区及主要抗原区，确定选取亲水性较强、暴

露率较高的主要抗原区Gn 1进行引物设计。根据选

取的RVFV

Gn1

基因的核苷酸序列和载体pFastBac

HTB图谱设计两对引物。引物设计时，在上游引物

中加入蜂素信号肽序列（5'-ATGAAATTCTTAGTC

AACGTTGCCCTTGTTTTATGG-3'），分别扩增不

含信号肽序列RVFV

Gn1

基因以及含有信号肽序列

的RVFV

Gn1

-F基因。同时，参照Bac-to-Bac杆状

病毒表达系统说明书，设计鉴定DH10bac杆粒的通

用引物M13引物。以上引物均由生工生物工程（上

海）有限公司合成（表1）。

1.4 重组转移载体构建

以合成的RVFV

1质粒为

模板分别扩增包含蜂素信号肽序列和不包含蜂素

信号肽序列的

Gn1

基因片段，将扩增的片段（带蜂

素信号肽序列850 bp左右，不带蜂素信号肽序列

800 bp左右）用限制性内切酶

Bam

HⅠ和

Eco

RⅠ双

酶切，分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB

（4856 bp）中（图1），经酶切及测序鉴定，获

得两个重组质粒pFastBac HTB-RVFV-F-

Gn1

及

pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

。

128

中国动物传染病学报

表 1 寡核苷酸引物序列

Table 1 Sequence of O ligonucleotide Primers

2022年4月

基因

Gene

RVFV-

RVFV-F-

M13

引物名称

Primer name

引物序列（5'-3'）

Sequence of primers (5'-3')

CGGGATCCGCCACCATGGCAATGGAGG

ACCCCCATCTGA

CCGCTCGAGCGGCTAGTGATGGTGATGG

TGATGGTCGCCGGTGCACTTCTTTG

CGGGATCCGCCACCATGGCAATGAAATT

CTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGG

TCGTGTACATTTCTTACATCTATGCG

AGTCCTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGA

TGTGACCCCGCTGTCACCATTGAC

CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG

AGCGGATAACAATTTCACACAGG

产物大小

Primer size

800 bp

Gn1

-HTB-F

Gn1

-HTB-R

Gn1

-F-HTB-F

Gn1

-F-HTB-R

850 bp

3000 bp

图1 pFastBac HTB-RVFV-F-

Gn1

及pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

质粒构建示意图

Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction of pFastBac HTB-RVFV-F-

Gn1

and pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

1.5 重组杆状病毒杆粒构建

将构建成功的重组质粒

HTB-RVFV-F-

Gn1

及pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

转

化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，同时将未插入外

源基因的质粒pFastBac HTB转化大肠杆菌DH10Bac

感受态细胞作为阴性对照。经多重蓝白斑筛选，获

取阳性重组菌株，提取杆粒并进行PCR鉴定，正确

后命名为rBacmid-HTB-RVFV-F-

Gn1

及rBacmid-

HTB-RVFV-

Gn1

。

1.6 重组杆状病毒的制备和鉴定

将生长状态良好

的Sf9细胞分别均匀接种6孔和24孔细胞板，按照

Lipofectamine

3000说明书操作方法，将上述杆粒

转染至其中，24孔板细胞同时转染实验室已验证成

功的CMV-JEV-NS5真核质粒作为阳性对照。将转

染后的细胞置于28℃继续培养72 h，当转染细胞出

现明显细胞病变（cytopathogenic effects, CPE）后，

离心收集6孔板细胞上清液，上清液即为P1代重组

病毒。24孔板细胞，一部分去上清液固定，使用

His一抗进行IFA鉴定，剩下的细胞分别收集细胞培

养基上清液、细胞裂解上清液、细胞裂解沉淀进行

SDS-PAGE和Western blot分析。

1.7 重组杆状病毒的扩增

使用前述IFA和Western blot

均已验证成功表达蛋白的P1代重组杆状病毒接毒于

Sf9细胞进行传代增殖，培养72~120 h待细胞发生明

显病变后收取上清液获得毒力更强的P2代病毒，同

样的传代方法获得P3代毒。获取的病毒使用半数组

织培养感染剂量（median tissue culture infective dose,

TCID

）方法测定毒价后分装冻存于-80℃冰箱。

1.8 重组蛋白的表达纯化

使用能够更高效表达外源

蛋白的High5细胞，感染不同剂量的P3代杆状病毒

培养至不同时间点，摸索重组杆状病毒最优表达条

件。在最优表达条件下，大量培养High5细胞，收集

细胞上清液或细胞裂解上清液，0.22

m滤器过滤，

然后用纯化仪纯化，并使用10 kDa超滤管浓缩，最

终获得浓度较高的纯化蛋白。

2 结果

2.1 目的基因扩增与重组质粒构建以RVFV

Gn1

质

粒为模板，分别扩增带蜂素信号肽序列的

Gn1

片段

第30卷第2期孙潇等：裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

129

和不带蜂素信号肽序列的

Gn1

片段，扩增产物经电

泳分析，可见约为850 bp（图2A）和800 bp的目的

条带（图2B）。将扩增产物克隆至pFastBac HTB载

bpM 1 2 3 4 5 6

体，经酶切鉴定（图3）并测序，结果与预期相符，

表明

Gn1

重组转移载体构建成功。

M 7 8 9 10

2000

1000

750

2000

1000

750

858

795

A B

图2 RVFV-

Gn1

（A）及RVFV-F-

Gn1

（B）基因 PCR 扩增图

Fig.2 PCR Ampliﬁ cation for RVFV-

Gn1

(A) and RVFV-F-

Gn1

(B)

M: DNA相对分子量标准（DL2000）; 1~6: RVFV-

Gn1

基因的扩增结果; 7~10: RVFV-F-

Gn1

基因的扩增结果

cation for RVFV-F-

Gn1

M: DL2000 DNA marker; 1-6: The results of PCR ampliﬁ cation for RVFV-

Gn1

; 7-10: The results of PCR ampliﬁ

5000

3000

2000

1500

1000

750

500

795

M 1 2 3M 4 5

5000

3000

2000

1500

1000

750

500

858

A B

图3 重组质粒pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

（A）和pFastBac HTB-RVFV-F-

Gn1

（B）的酶切鉴定

Fig.3 Identiﬁ cation of recombinant plasmids pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

(A) and pFastBac HTB-RVFV-F-

Gn1

restriction enzyme digestion (B)

M: DNA相对分子质量标准（DL5000）; 1~3: pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

的酶切鉴定结果; 4~5: pFastBac HTB-RVFV-F-

Gn1

的酶切

鉴定结果

M: DL5000 DNA marker; 1-3: The results of restriction enzyme digestion for pFastBac HTB-RVFV-

Gn1

; 4-5: The results of restriction

enzyme digestion for pFastBac HTB-RVFV-F-

Gn1

2.2 重组杆粒的构建及鉴定

以提取的重组杆粒为模

板进行PCR，使用M13通用引物进行PCR，结果如图

4所示，由M13上、下游引物扩增可见一条清晰的目

的条带，条带均约为3000 bp，大小与理论相符，证

明重组杆粒rBacmid-HTB-RVFV-F-

Gn1

及rBacmid-

HTB-RVFV-

Gn1

构建成功。

2.3 重组杆状病毒在Sf9细胞中表达Gn1蛋白检

测

将鉴定成功的重组杆粒及CMV-JEV-NS5真核

表达质粒同时转染Sf9细胞，72 h后可观察到转染

杆粒后的Sf9细胞出现了明显的细胞病变。对细胞

进行固定处理，使用His一抗进行间接免疫荧光检

测，可见转染了rBacmid-HTB-RVFV-F-

Gn1

及

rBacmid-HTB-RVFV-

Gn1

杆粒的细胞出现了与阳性

对照类似的特异性荧光，并且转染rBacmid-HTB-

RVFV-

Gn1

杆粒的细胞荧光更强，而转染了空杆

粒的阴性对照组没有出现荧光（图5）。收集转染

130

中国动物传染病学报

2022年4月

rBacmid-HTB-RVFV-

Gn1

杆粒的细胞培养上清液、

细胞裂解上清液和细胞裂解沉淀进行SDS-PAGE及

Western blot分析，可以看到在细胞裂解上清样和细

5000

3000

2000

1500

1000

750

500

胞裂解沉淀样泳道出现了符合预期大小36 kDa的条

带（图6），证明重组杆状病毒在Sf9细胞中成功表

达出Gn1蛋白。

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3000

图4 重组穿梭质粒的鉴定结果

Fig.4 PCR identiﬁ cation of the recombinant bacmid plasmid

M: DNA相对分子质量标准（DL5000）; 1-5: rBacmid-HTB-RVFV-F-

Gn1

M13引物鉴定结果; 6-10: rBacmid-HTB-RVFV-

Gn1

M13

引物鉴定结果

ed by M13 primers; 6-10: rBacmid-HTB-RVFV-

Gn1

identiﬁ ed by

M: DL5000 DNA marker; 1-5: rBacmid-HTB-RVFV-F-

Gn1

identiﬁ

M13 primers

阳性对照阴性对照

Bacmid-HTB-F-RVFV-

Gn1

Bacmid-HTB-RVFV-

Gn1

图5 重组杆粒在sf9细胞转染表达间接免疫荧光结果

Fig.5 Expression of rBacmid on sf9 cells transduction with IFA

A: 阳性对照; B: 阴性对照; C: Bacmid HTB-F-RVFV-

Gn1

; D: Bacmid HTB-RVFV-

Gn1

A: Positive control; B: Negetive control; C: BacmidBac HTB-F-RVFV-

Gn1

; D: Bacmid HTB-RVFV-

Gn1

第30卷第2期孙潇等：裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

131

kDa

130

M 1 2 3 4 5 6

1 2 3

图6 rBacmid-RVFV-

Gn1

细胞裂解上清液中重组蛋白的SDS-PAGE分析

Fig.6 SDS-PAGE of recombinant protein RVFV-

Gn1

from cell lysis supernatant

A: 考马斯亮蓝染色结果; B: Western blot结果

A: The result of coomassie brilliant blue staining; B: The result of Western blot

M: 蛋白质相对分子量标准; A1: 细胞全液; A2: 阴性细胞全液; A3: 细胞裂解上清液; A4: 细胞裂解沉淀; A5: 细胞培养上清液;

A6: 阴性细胞培养上清液; B1: 细胞培养上清液; B2: 细胞裂解上清液; B3: 细胞裂解沉淀

M: Protein marker; A1: rBacmid-RVFV-

Gn1

cell; A2: Negative cells; A3: Cell lysis supernatant; A4: Cell lysis and precipitation;

A5: Supernatant of cell culture medium; A6: Supernatant of negative cell culture medium

B1: Supernatant of cell culture medium; B2: Cell lysis supernatant; B3: Cell lysis precipitation

2.4 重组杆状病毒制备与扩增

6孔板Sf9细胞转染

rBacmid-HTB-RVFV-

Gn1

杆粒72 h后，待细胞出现

明显病变后收集细胞上清液，获得P1代重组杆状病

毒。将此重组病毒感染Sf9细胞进行传代增殖至第三

代，P3代重组毒可观察到明显细胞病变现象，细胞

生长缓慢，开始膨大、裂解、脱落（图7）。

图7 重组杆状病毒 rBacmid-RVFV-

Gn1

的细胞病变效应

Fig.7 Cytopathic effect of recombinant baculovirus rBacmid-RVFV-

Gn1

A: 正常sf9细胞; B: rBacmid-RVFV-

Gn1

感染sf9细胞

A: Normal sf9 cell; B: sf9 cell infected with rBacmid-RVFV-

Gn1

baculovirus

132

中国动物传染病学报

2022年4月

2.5 重组Gn1蛋白的大量表达纯化

使用能够更高效

表达外源蛋白的High5细胞接种6孔细胞板，分别感

染1 MOI、2 MOI和3 MOI重组杆状病毒，感染后

48 h和72 h收集细胞，细胞裂解上清液经Western blot

分析显示，接毒量1 MOI，感染时间72 h为重组杆状

48 h

M 1 2 3 4

病毒感染细胞后蛋白表达的最优条件（图8）。在

此最优条件下，大量收集细胞裂解上清液，过滤纯

化并浓缩，最终产物经SDS-PAGE及Western blot分

析，特异性反应的蛋白条带大小符合预期，且纯化

效果较好（图9）。

72 h

M 1 2 3 4

图8 重组杆状病感染细胞蛋白最优表达条件Western blot分析

Fig.8 Western blot analysis of optimum expression condition of rBacmid baculovirus infection

A: 感染后48 h组; B: 感染后72 h组. M: 蛋白质相对分子量标准; 1: 3 MOI; 2: 2 MOI; 3: 1 MOI; 4: 对照

A: Infected for 48 h; B: Infected for 72 h. M: Protein marker; 1: 3 MOI; 2: 2 MOI; 3: 1 MOI; 4: Control

kDa

130

M 1 2 3

3 讨论

RVF是由RVFV感染引起的一种严重威胁全球

动物和人类健康的烈性传染病

[7]

，但目前针对该病尚

无商品化的疫苗。RVFV Gn蛋白可刺激宿主产生中

和抗体，是研究RVF基因工程亚单位疫苗的重要结

构蛋白。杆状病毒表达系统是目前最常用的真核表

达系统之一，其能够高水平地保真蛋白原本结构及

功能特点，维持蛋白的生物活性，在病毒亚单位疫

苗研究方面具有显著优势。基于此，本研究以RVFV

Gn蛋白的截短体Gn1蛋白（Gn的主要抗原区）为研

究对象，将其克隆至杆状病毒载体构建重组杆状病

毒，最终成功在杆状病毒表达系统中表达出rGn1蛋

白，为RVF诊断试剂盒及亚单位疫苗的研发提供了

物质基础。

图9 rBacmid-RVFV-

1 SDS-PAGE和Western blot结果

Fig.9 SDS-PAGE and Western blot analysis of

rBacmid-RVFV-

M: 蛋白质相对分子量标准; 1: 接毒细胞培养基上清液;

2: 纯化浓缩后rRVFV-Gn1蛋白; 3: 空白细胞培养基上清液

M: Protein marker; 1: The supernatant of infected High5;

2: The puriﬁ ed recombinant protein rBacmid-RVFV-Gn1;

3: The supernatant of High5

基因全长1610 bp，考虑到Gn蛋白较大，为

方便后期克隆及表达，本研究选择了RVFV Gn蛋白

的主要抗原表位区域的截短体Gn1进行杆状病毒的

构建并在昆虫细胞中表达纯化。实验结果表明rGn1

蛋白保留了Gn蛋白的反应原性，并且通过后期与原

核表达的rGn1蛋白免疫小鼠血清反应，证明其也有

很好的免疫原性。此外，我们还尝试使用不同载体

和添加蜂素信号肽的方式，增加重组蛋白被分泌到

第30卷第2期孙潇等：裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

133

培养基上清中的可能性。我们选用了pFastBac1（结

果未显示）和pFastBac HTB两种载体，但是最终只

有pFastBac HTB载体的重组质粒正确表达，并且添

加蜂素信号肽对于重组蛋白分泌表达的作用不大。

虽然最终的重组蛋白并未大量表达在培养上清液中

（主要在细胞裂解上清液和裂解沉淀中），我们通

过纯化细胞裂解上清液依然获得了纯度较好的rGn1

重组蛋白。但是由于细胞裂解上清液的量较少，获

取大量重组纯化蛋白成本较高，后期还需进一步

摸索条件，使rGn1蛋白能够在培养上清液中大量

表达。

pFastBac HTB载体本身带有6×His标签，为了

获取高纯度的rGn1蛋白，我们将最终产物使用His-

NI柱亲和层析法进行了纯化。但是单一使用亲和层

析方法进行纯化，效果并不是最好，会得到一些杂

蛋白。我们的结果也显示纯化后的重组蛋白还是存

在少量非目的蛋白，后期还需使用分子筛及离子交

换层析对所获得的蛋白进行进一步纯化。

参考文献

[1] Olaleye O D, Tomori O, Ladipo M A,

et al.

Rift Valley

fever in Nigeria: infections in humans[J]. Rev Sci Tech,

1996, 15(3): 923-935

[2] Thiongane Y, Thonnon J, Zeller H,

et al.

Recent data

on Rift Valley Fever epidemiology in Senegal[J]. Dakar

Med, 1996(Spec No): 1-6.

[3] Oyas H, Holmstrom L, Kemunto N P,

et al

. Enhanced

surveillance for Rift Valley Fever in livestock during El

Nino rains and threat of RVF outbreak, Kenya, 2015-

2016[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2018, 12(4): e0006353.

[4] Fu X, Wang L, Fang B,

et al.

Import of Rift Valley fever

to China: a potential new threat[J]? Virol Sin, 2016,

31(5): 454-456.

[5] Spengler J R, McElroy A K, Harmon J R,

et al.

Human

immune cell engraftment does not alter development of

severe acute Rift Valley fever in mice[J]. PLoS One,

2018, 13(7): e0201104.

[6] Fyumagwa R D, Ezekiel M J, Nyaki A,

et al

. Response

to Rift Valley Fever in Tanzania: Challenges and

Opportunities[J]. Tanzan J Health Res, 2011, 13(5 Suppl):

332-339.

[7] Fafetine J M, Coetzee P, Mubemba B,

et al.

Rift Valley

Fever Outbreak in Livestock, Mozambique, 2014[J].

Emerg Infect Dis, 2016, 22(12): 2165-2167.

[8] Rice R M, Erlick B J, Rosato R R,

et al

. Biochemical

characterization of Rift Valley Fever virus[J]. Virology,

1980, 105(1): 256-260.

[9] Collett M S, Purchio A F, Keegank K,

et al.

Complete

nucleotide sequence of the M RNA segment of Rift Valley

Fever virus[J]. Virology, 1985, 144(1): 228-245.

[10] Brand R F, Rostal M K, Kemp A,

et al

. A phytosociological

analysis and description of wetland vegetation and

ecological factors associated with locations of high

mortality for the 2010-11 Rift Valley fever outbreak in

South Africa[J]. PLoS One, 2018, 13(2): e0191585.