2024年4月4日发(作者：泉怀桃)

高级生物与分子生物学

实验报告

姓名：

学号：

指导老师：

实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达

【实验原理】：

1. DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼

脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T

4

DNA

连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。

2. 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠

杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受

态细胞。由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因（本实验

质粒带有卡那霉素抗性基因），根据转化菌的耐药特性进行删选。

3. 裂解法小量制备质粒DNA的原理

：

SDS和NaOH使蛋白质和染色体

DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA

存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的

蛋白质。

4. 重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，

酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。

5. 组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该

启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导。IPTP的终

浓度为1mmol/L。

6. 融合蛋白的表达检测的原理

：

经诱导表达的重组体裂解后，经

SDS-PAGE鉴定。染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无

此蛋白带。

【实验步骤】：

1.配制LB和LK培养基

2.连接：质粒片断＋目的基因 （1.5ml离心管），16℃水浴过夜，65℃

水浴10min，灭火连接酶。

ddH2O 12ul

X-DNA(目的基因） 3ul

pET-28a（质粒片断） 2ul

10×buffer 2ul

T4 ligase 1ul

3.复苏DH5a和BL21，并接种DH5a 1支，接种BL21 1支（10ul菌液

+2ml LB）于试管，第二天7：30分别转接DH5a和BL21

（1ml+20mlLB）于烧瓶。（分别准备制备感受态，两个连接反应用

来转化）

5a和BL21感受态细胞的制备： 在烧瓶孵育2.5h后，取1.5ml

菌液至1.5ml离心管，4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/l

CaCl

2

，混匀，离心4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/l

CaCl

2

，混匀，冰浴30min，离心（4℃，4000rmp，5min），弃上

清。加100ul 100mmol/l CaCl

2

,重新悬浮沉淀。

5.转化：另取1.5ml离心管，加连接反应液20ul，再加50ul DH5a

和BL21感受态细菌，混匀，冰浴30min。42℃水浴90s，再冰浴

1-2min。加500ulLB，37℃摇床培养1h。5000rpm, 离心3分钟

倒上清，重悬沉淀。

6.涂板，37度过夜培养（DH5α：感受态一块LB,感受态一块LK 转

化菌一块LK, BL21同样）

7.检查细菌生长情况，只有转化菌才能在含卡那霉素的培养基生长

密集生长

无细菌生长

均匀分布

8．质粒提取-碱裂解法

9.质粒酶切反应：在1.5ml离心管中加入以下物质，充分混匀后，瞬

时离心，37度保温1-2小时

ddH2O

10buffer

质粒

BamH I

Xho I

Total

单酶切(ul)

14

2ul

3ul

1

/

20

双酶切(ul)

13

2

3

1

1

20

10.琼脂糖凝胶电泳：溶胶（用TAE缓冲液，充分融化），稍冷却后

倒胶，加样（样品要加样品缓冲液至1），电泳（1-10V/CM)，染色

与观察拍照。

11.蛋白诱导表达：（BL21）

-PAGE过程

①配胶

②样品制备

③加样

④电泳（200V）

⑤染色：考马斯亮蓝染色或银染

【实验结果】：

重组质粒的鉴定

空 双 单 质 Ｍ 双 单 质

融合蛋白的表达检测

0h 1h 3h 0h 1h 3h

【实验分析】：

⑴ 在重组质粒酶切鉴定图谱中，第一加样泳道为DNA marker, 接下

来的三泳道依次为：没有经过酶切的重组质粒加样泳道，双酶切的重

组质粒加样泳道，单酶切的重组质粒加样泳道。经过分析，经单酶切

的重组质粒两片段的分子量大小分别符合载体pET28a（+）和目的基

因X的大小，即重组质粒构建基本成功。但是，每一泳道都有拖尾，

这可能是酶切时间过短，使酶切不彻底，也可能是限制性内切酶活性

不高，未放于冰上，使其酶切效果不佳。也有可能是胶制作不理想或

者电解液不纯所造成。总之，能引起跑胶拖尾的原因很多，必须每一

步都正规操作，尽量防止这种情况的出现。

⑵在不同时间间隔IPTG诱导重组质粒表达蛋白图中，从左边起的第

一至第三泳道分别是时间间隔为0h,1h,2h重组质粒经异丙基硫代半

乳糖苷(IPTP)诱导在BL-21细胞中蛋白表达后用考马斯亮蓝染色的

图示，可以看出蛋白表达量依次增多。

实验二：脲酶的分离纯化及比活性测定

【实验仪器、试剂】：

仪器：

层析柱ч1.2cm×20cm 恒温水浴箱 751或者752紫外分光光度计

721分光度计

试剂：

1、3%尿素

2、0.1mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液

3、1mol/L HCl

4、32%丙酮溶液

5、纳氏试剂

6、0.001mol/L标准硫酸铵溶液

【实验原理】：

蛋白质（酶）是非常重要的生物大分子，其性质差异很大。蛋

白质的分离和提纯工作室一项艰巨而又复杂的任务。到目前为止，还

没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混

合物中提取出来，但对于任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离

提纯程序来获取高纯度的制品

脲酶分子量较大，达490kD。当脲酶粗制品通过交联葡聚糖

SephadexG-200层析柱时，此酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内。而

其它小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒，因此，

用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与

其他物质分离的目的。定时或定量收集洗脱液，分别在752分光光度

计282nm波长测定其吸光度，再分别测定洗脱峰内各管的酶活性，

以酶活性为纵坐标，以管号为横坐标，会出酶活性曲线，酶活性与蛋

白质洗脱曲线中峰值重叠的部分即为分离所得到的脲酶所在部位。

酶活性测定系根据酶催化尿素水解释出氨和CO

2

作用。

【实验步骤】：

1. 制备脲酶粗提液

2.凝胶过滤层析

①装柱：保持竖直，防分层、干裂

②平衡：装好后用蒸馏水平衡

③加样：加0.6ml粗提液

④洗脱与收集：用蒸馏水洗脱，3ml/15分钟/管，收集12管

3.蛋白质含量检测

4.蛋白质活性检测

【实验结果】：

1. 硫酸铵标准曲线绘制：

管号

1

试剂

0.001M硫酸铵(ml) 0.1 0.2 0.3

0.4 0.6

2.8 2.7

0.4 0.5 0.6 -

0.8 1 1.2 -

2 3 4 5 6 7

含NH3的微克分子数 0.2

H2O（ml) 2.9 2.6 2.5 2.4 3

混 匀

奈氏试剂

A480

0.75ml, 立即混匀

0.548 1.048 1.575 1.834 2.424 2.862 0

硫酸铵标准曲线

4.5

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

-0.5

0

y = 3.2234x - 0.183

R

2

= 0.9534

A

4

8

0

A480

线性 (A480)

0.20.40.60.8

NH3的μmol数

11.21.4

2.蛋白含量测定：

空

白

1 2 3 4 5

洗脱液

6 7 8 9 10 11

粗提液

(1:20稀

12

释)

洗脱液蛋白含量

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

-0.5

0246

管数

8101214

蛋

白

含

量

（

m

g

/

m

l

）

系列1

3.酶促反应：

洗脱液

空白

1 2 3

粗提液

… 9 10 11 12

(1:20稀

释)

3%尿素0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

(ml)

0.1M PBS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

37度保温15分钟

酶液

H2O

-- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

0.5 -- -- -- -- -- -- -- -- --

混匀，37度保温15分钟

向各管加入1M HCl 0.5ml,放置5分钟，加1M NaOH 0.5ml终止反

应

4. 显色与测定

空

白

1

0.5

洗脱液

2

0.5

3

0.5

4

0.5

5 6 7 8

0.5

9

0.5

10

0.5

11

0.5

粗提液

(1:20稀

12

释

)

上述反应

0.5

液

H2O

奈氏试剂

A480

0.5 0.5 0.5 0.5 0.1

每管加0.75ml,混匀,测量480mm吸光度

5.酶活性计算

空

洗脱液

粗提

白

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

-

液

(1:20

稀释)

A480

NH3(umol)

0 - 0.010.375 4.250 2.682.802 0.215 0.410.130.010.02

4 5 7 6 8 3

0.06

活性/ml

洗脱液

活性/管

[蛋白]

（mg/ml）

(10

-3

)

比活性

[单位：NH3(umol)数/mL[洗脱液·h]

蛋白浓度（mg/ml）=A2800.75

活性/ml洗脱液 = NH3(umol)数3.0/取酶促反应液ml数1/0.560/15

活性/管 =活性/ml洗脱液  3

比活性 =每毫升洗脱液的活性/每毫升洗脱液的蛋白含量

酶活性图

250

200

酶

活

性

150

系列1

100

50

0

0246

管数

8101214

【实验分析】：

由图可知：酶活性与蛋白质洗脱曲线中峰值重叠的部分在第三管

或者第四管，即脲酶所在部位为第三或者第四管。实验过程中，显色

反应是第四管黄色最深最明显，由此可知，第四管的脲酶活性最大。

但是，酶的比活性却是第十一管最高。这可能是酶蛋白含量的差距比

酶活性的差异大的多，所造成的结果。

2024年4月4日发(作者：泉怀桃)

高级生物与分子生物学

实验报告

姓名：

学号：

指导老师：

实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达

【实验原理】：

1. DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼

脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T

4

DNA

连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。

2. 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠

杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受

态细胞。由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因（本实验

质粒带有卡那霉素抗性基因），根据转化菌的耐药特性进行删选。

3. 裂解法小量制备质粒DNA的原理

：

SDS和NaOH使蛋白质和染色体

DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA

存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的

蛋白质。

4. 重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，

酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。

5. 组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该

启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导。IPTP的终

浓度为1mmol/L。

6. 融合蛋白的表达检测的原理

：

经诱导表达的重组体裂解后，经

SDS-PAGE鉴定。染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无

此蛋白带。

【实验步骤】：

1.配制LB和LK培养基

2.连接：质粒片断＋目的基因 （1.5ml离心管），16℃水浴过夜，65℃

水浴10min，灭火连接酶。

ddH2O 12ul

X-DNA(目的基因） 3ul

pET-28a（质粒片断） 2ul

10×buffer 2ul

T4 ligase 1ul

3.复苏DH5a和BL21，并接种DH5a 1支，接种BL21 1支（10ul菌液

+2ml LB）于试管，第二天7：30分别转接DH5a和BL21

（1ml+20mlLB）于烧瓶。（分别准备制备感受态，两个连接反应用

来转化）

5a和BL21感受态细胞的制备： 在烧瓶孵育2.5h后，取1.5ml

菌液至1.5ml离心管，4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/l

CaCl

2

，混匀，离心4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/l

CaCl

2

，混匀，冰浴30min，离心（4℃，4000rmp，5min），弃上

清。加100ul 100mmol/l CaCl

2

,重新悬浮沉淀。

5.转化：另取1.5ml离心管，加连接反应液20ul，再加50ul DH5a

和BL21感受态细菌，混匀，冰浴30min。42℃水浴90s，再冰浴

1-2min。加500ulLB，37℃摇床培养1h。5000rpm, 离心3分钟

倒上清，重悬沉淀。

6.涂板，37度过夜培养（DH5α：感受态一块LB,感受态一块LK 转

化菌一块LK, BL21同样）

7.检查细菌生长情况，只有转化菌才能在含卡那霉素的培养基生长

密集生长

无细菌生长

均匀分布

8．质粒提取-碱裂解法

9.质粒酶切反应：在1.5ml离心管中加入以下物质，充分混匀后，瞬

时离心，37度保温1-2小时

ddH2O

10buffer

质粒

BamH I

Xho I

Total

单酶切(ul)

14

2ul

3ul

1

/

20

双酶切(ul)

13

2

3

1

1

20

10.琼脂糖凝胶电泳：溶胶（用TAE缓冲液，充分融化），稍冷却后

倒胶，加样（样品要加样品缓冲液至1），电泳（1-10V/CM)，染色

与观察拍照。

11.蛋白诱导表达：（BL21）

-PAGE过程

①配胶

②样品制备

③加样

④电泳（200V）

⑤染色：考马斯亮蓝染色或银染

【实验结果】：

重组质粒的鉴定

空 双 单 质 Ｍ 双 单 质

融合蛋白的表达检测

0h 1h 3h 0h 1h 3h

【实验分析】：

⑴ 在重组质粒酶切鉴定图谱中，第一加样泳道为DNA marker, 接下

来的三泳道依次为：没有经过酶切的重组质粒加样泳道，双酶切的重

组质粒加样泳道，单酶切的重组质粒加样泳道。经过分析，经单酶切

的重组质粒两片段的分子量大小分别符合载体pET28a（+）和目的基

因X的大小，即重组质粒构建基本成功。但是，每一泳道都有拖尾，

这可能是酶切时间过短，使酶切不彻底，也可能是限制性内切酶活性

不高，未放于冰上，使其酶切效果不佳。也有可能是胶制作不理想或

者电解液不纯所造成。总之，能引起跑胶拖尾的原因很多，必须每一

步都正规操作，尽量防止这种情况的出现。

⑵在不同时间间隔IPTG诱导重组质粒表达蛋白图中，从左边起的第

一至第三泳道分别是时间间隔为0h,1h,2h重组质粒经异丙基硫代半

乳糖苷(IPTP)诱导在BL-21细胞中蛋白表达后用考马斯亮蓝染色的

图示，可以看出蛋白表达量依次增多。

实验二：脲酶的分离纯化及比活性测定

【实验仪器、试剂】：

仪器：

层析柱ч1.2cm×20cm 恒温水浴箱 751或者752紫外分光光度计

721分光度计

试剂：

1、3%尿素

2、0.1mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液

3、1mol/L HCl

4、32%丙酮溶液

5、纳氏试剂

6、0.001mol/L标准硫酸铵溶液

【实验原理】：

蛋白质（酶）是非常重要的生物大分子，其性质差异很大。蛋

白质的分离和提纯工作室一项艰巨而又复杂的任务。到目前为止，还

没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混

合物中提取出来，但对于任何一种蛋白质都可能选择一套适当的分离

提纯程序来获取高纯度的制品

脲酶分子量较大，达490kD。当脲酶粗制品通过交联葡聚糖

SephadexG-200层析柱时，此酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内。而

其它小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒，因此，

用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与

其他物质分离的目的。定时或定量收集洗脱液，分别在752分光光度

计282nm波长测定其吸光度，再分别测定洗脱峰内各管的酶活性，

以酶活性为纵坐标，以管号为横坐标，会出酶活性曲线，酶活性与蛋

白质洗脱曲线中峰值重叠的部分即为分离所得到的脲酶所在部位。

酶活性测定系根据酶催化尿素水解释出氨和CO

2

作用。

【实验步骤】：

1. 制备脲酶粗提液

2.凝胶过滤层析

①装柱：保持竖直，防分层、干裂

②平衡：装好后用蒸馏水平衡

③加样：加0.6ml粗提液

④洗脱与收集：用蒸馏水洗脱，3ml/15分钟/管，收集12管

3.蛋白质含量检测

4.蛋白质活性检测

【实验结果】：

1. 硫酸铵标准曲线绘制：

管号

1

试剂

0.001M硫酸铵(ml) 0.1 0.2 0.3

0.4 0.6

2.8 2.7

0.4 0.5 0.6 -

0.8 1 1.2 -

2 3 4 5 6 7

含NH3的微克分子数 0.2

H2O（ml) 2.9 2.6 2.5 2.4 3

混 匀

奈氏试剂

A480

0.75ml, 立即混匀

0.548 1.048 1.575 1.834 2.424 2.862 0

硫酸铵标准曲线

4.5

4

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

-0.5

0

y = 3.2234x - 0.183

R

2

= 0.9534

A

4

8

0

A480

线性 (A480)

0.20.40.60.8

NH3的μmol数

11.21.4

2.蛋白含量测定：

空

白

1 2 3 4 5

洗脱液

6 7 8 9 10 11

粗提液

(1:20稀

12

释)

洗脱液蛋白含量

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0

-0.5

0246

管数

8101214

蛋

白

含

量

（

m

g

/

m

l

）

系列1

3.酶促反应：

洗脱液

空白

1 2 3

粗提液

… 9 10 11 12

(1:20稀

释)

3%尿素0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

(ml)

0.1M PBS 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

37度保温15分钟

酶液

H2O

-- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

0.5 -- -- -- -- -- -- -- -- --

混匀，37度保温15分钟

向各管加入1M HCl 0.5ml,放置5分钟，加1M NaOH 0.5ml终止反

应

4. 显色与测定

空

白

1

0.5

洗脱液

2

0.5

3

0.5

4

0.5

5 6 7 8

0.5

9

0.5

10

0.5

11

0.5

粗提液

(1:20稀

12

释

)

上述反应

0.5

液

H2O

奈氏试剂

A480

0.5 0.5 0.5 0.5 0.1

每管加0.75ml,混匀,测量480mm吸光度

5.酶活性计算

空

洗脱液

粗提

白

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

-

液

(1:20

稀释)

A480

NH3(umol)

0 - 0.010.375 4.250 2.682.802 0.215 0.410.130.010.02

4 5 7 6 8 3

0.06

活性/ml

洗脱液

活性/管

[蛋白]

（mg/ml）

(10

-3

)

比活性

[单位：NH3(umol)数/mL[洗脱液·h]

蛋白浓度（mg/ml）=A2800.75

活性/ml洗脱液 = NH3(umol)数3.0/取酶促反应液ml数1/0.560/15

活性/管 =活性/ml洗脱液  3

比活性 =每毫升洗脱液的活性/每毫升洗脱液的蛋白含量

酶活性图

250

200

酶

活

性

150

系列1

100

50

0

0246

管数

8101214

【实验分析】：

由图可知：酶活性与蛋白质洗脱曲线中峰值重叠的部分在第三管

或者第四管，即脲酶所在部位为第三或者第四管。实验过程中，显色

反应是第四管黄色最深最明显，由此可知，第四管的脲酶活性最大。

但是，酶的比活性却是第十一管最高。这可能是酶蛋白含量的差距比

酶活性的差异大的多，所造成的结果。