2024年4月9日发(作者：关正真)
5现代免疫学62008年第28卷第3期
#177#
M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析
李 康,郭 强,王翠妮,陈 敏,徐 薇
,熊思东
(复旦大学免疫生物学研究所,复旦大学上海医学院免疫学系上海200032)
摘要:通过对M1和M2型巨噬细胞表型相关指标的比较分析,评价各鉴定巨噬细胞类型的表型指标及其意义。按常规方
法以IFN2C及LPS将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞,以IL24诱导出M2型巨噬细胞。分别以RT2PCR和酶活性
定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性;以ELISA检测IL212和IL210的分泌;以FACS检测巨噬细胞膜分子的表
达。结果显示:M1型巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)表达和活性水平较未刺激组明显
升高,IL212产生显著增加,CD16/32表达上调;而M2型巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase1,Arg21)的表达水平和酶活性
较未刺激巨噬细胞显著提高,IL210分泌轻度增加,并且表达高水平的CD206和DECTIN21。表型比较分析结果表明,iN2
OS表达和活性、IL212的分泌和膜蛋白CD16/32可用于鉴定M1型巨噬细胞,而Arg21、CD206和DECTIN21是鉴定M2
型巨噬细胞较为理想的表型指标。
关键词:M1型巨噬细胞;M2型巨噬细胞;表型分析
中图分类号:R392.12文献标识码:A文章编号:100122478(207
#
巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞
群体,在体内外不同的微环境影响下,表现出明显
的功能差异
[1,2]
。目前根据活化状态和发挥功能的
不同,巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨
噬细胞(classicallyactivatedmacrophage),和M2
型即替代性活化的巨噬细胞(alternativelyactivated
macrophage)
[3,4]
。在体外培养条件下,通过IFN2C
及脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导产生M1
型巨噬细胞和通过Th2型细胞因子(如IL24、IL2
13等)诱导产生M2型巨噬细胞,具有与体内极化
的巨噬细胞相似的表型和功能,已成为研究巨噬细
胞异质性的重要手段。
在机体不同生理和疾病状态下,巨噬细胞表现
出不同的类型,通过表型分析鉴定巨噬细胞类型已
成为研究巨噬细胞功能多样性的主要方法。已有文
献主要从精氨酸代谢途径、细胞因子分泌
和表面分子的表达
[9,10]
等方面区分M1型与M2型
巨噬细胞。然而,到目前为止,关于M1和M2型
巨噬细胞的表型特征尚未统一。为了评价各种表型
收稿日期:2008202215
基金项目:新缰医科
作者简介:李 康(19832),男,硕士,主要从事巨噬细胞免疫调
节方面的研究。
通讯作者:熊思东(E2mail:sdxiongfd@);
#
指标及其意义,我们参照公认的经典的方法在体外
诱导了M1型和M2型巨噬细胞,对M1和M2表
型相关指标进行检测,进而相对量化地比较各表型
指标,以期为体内外鉴定巨噬细胞类型时表型指标
的选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠(H22
b
、4~6周
龄,雌性),体重16~20g,购自上海斯莱克实验
动物有限公司。清洁级饲养于复旦大学实验动物科
学部。
1.1.2 主要试剂 细胞培养基RPMI1640(Gibco
BRL公司),小牛血清(GibcoBRL公司),L2谷氨
酰胺(L2Glutamine)(政翔化学试剂研究所),双抗
(氨卞青霉素钠、硫酸链霉素)(上海第四制药厂),
胰酶(华美生物工程公司);小鼠重组IFN2C(Pep2
rotech公司),LPS(Sigma公司),小鼠重组IL24
(Peprotech公司);TaqDNA多聚酶、dNTP等
PCR试剂(Biostar公司),TRIzol(北京鼎国生物公
司),DEPC(Genetimes公司),M2MuLVReverse
Transcriptase(MBI公司);A2异亚硝基苯丙酮(A2
isonitrosopropiophenone)(Sigma公司),Arginine
(鼎国生物技术有限责任公司),NO检测试剂盒
(Cayman公司);小鼠IL210ELISA检测试剂盒
[5,6][7,8]
共同通讯作者
#178#
5现代免疫学62008年第28卷第3期
(eBioscience公司),小鼠IL212ELISA检测试剂
盒(eBioscience公司);FITC标记的大鼠抗小鼠
F4/80抗体(CALTAGLaboratories公司),PE标
记的驴抗大鼠IgG(H+L)抗体(eBioscience公
司),PE标记的抗小鼠CD16/32(FcCIII/FcCII受
体,2.4G2)抗体(BDPharmingen公司),未标记
大鼠抗小鼠CD206抗体(Serotec公司),未标记大
鼠抗小鼠MGL抗体由荷兰Erasmus医学中心Pi2
eterLeenen教授惠赠,未标记大鼠抗小鼠DEC2
TIN21抗体由南非CapeTown大学GordonBrown
教授惠赠。
1.1.3 引物 由北京赛百盛公司合成,本实验所
用引物见表1。
表1 引物序列
基因
iNOS
引物序列(F:正义链R:反义链)PCR片段(bp)
311
退火温度(e)
59
F:52CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG
R:52GGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA
F:52CAGAAGAATGGAAGAGTCAG
R:52CAGATATGCAGGGAGTCACC
F:52CTGCACCACCAACTGCTTAG
R:52GTCTGGGATGGAAATTGTGA
Arg2125059
GAPDH66056
1.2 方法
1.2.1 骨髓来源巨噬细胞的诱导 改进的Vats
等
[11]
的方法,将小鼠颈椎脱臼处死后,无菌分离
股骨和胫骨,用无菌2.5ml注射器吸入L929条件
培养基(含有20%小鼠成纤维细胞株L929培养3d
的上清、20%小牛血清、100U/ml青霉素、100
mg/ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培
养液),吹下骨髓内容物入一无菌平皿,并将细胞
充分吹匀,在L929条件培养基中培养,7d后去
除非贴壁细胞,再培养于完全RPMI1640培养基
(含10%小牛血清、1000U/ml青霉素、100mg/
ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)中,1d后收集
的贴壁细胞即为骨髓来源的巨噬细胞。
1.2.2 巨噬细胞的体外刺激 以0.25%胰蛋白酶
消化收集诱导成熟的巨噬细胞,根据各实验要求铺
于24孔或6孔细胞培养板中,参照Vats等的
方法,以IFN2C(100U/ml)和LPS(5ng/ml)共同
刺激培养24~96h,诱导出M1型巨噬细胞;参照
Odegaard等
的方法,以IL24(10ng/ml)刺激
培养24~96h诱导出M2型巨噬细胞。
1.2.3 总RNA抽提及RT2PCR 提取方法参照
试剂盒说明书进行,向刺激24h的细胞(约1@
10)中加入1000LlTRIzol,立即用1ml注射器
抽打5次;然后加入200Ll氯仿,混匀,室温静
置15min后12000@g高速低温离心20min;小
心将上层水相移至1.5ml离心管中加入500Ll异
丙醇,振荡混匀。220e放置30min沉淀RNA,
12000@g高速低温离心10min;小心弃去上清,
6
[10]
[11]
再在离心管中加入1ml75%乙醇,振荡片刻,8
000@g低温离心5min;小心弃去上清,室温静置
5~10min使RNA沉淀恰好干燥,加水溶解。将
TRIzol抽提的细胞总RNA,以逆转录进行cDNA
第一链的合成:1~5Lg总RNA中加1LlOligo
(dT)
15
,70e5min,于冰上加入5@缓冲液3
Ll,dNTP2Ll,RNasin0.5Ll,逆转录酶200
U,加水至总体积15Ll,42e延伸60min后,70
e10min。然后以cDNA为模板扩增iNOS和Arg2
1的基因编码片段,以鼠GAPDH为内参照,扩增
条件如下:94e预变性5min;94e变性30s,
59e退火30s,72e延伸30s,30个循环;72e
延伸10min。
1.2.4 iNOS活性测定 收集刺激后24h的培养
上清,按照NO检测试剂盒(硝酸还原酶法)操作说
明,取200Ll培养上清,加入100LlGriessRea2
gentR1,再加入等体积GriessReagentR2,混匀
室温静置10min,于540nm处检测各样品吸光度
(D值),以亚硝酸钠(NaNO
2
)建立标准曲线。
1.2.5 Arg21活性测定 参照Lumeng等
[8]
的方
法,以100Ll0.1%TritonX2100裂解刺激48h
后的细胞,加入100Ll50mmol/LTris2HCl和10
mmol/LMnCl
2
,56e温育10min,加入100Ll
0.5mol/LArginine,37e温育30min,加入800
LlH
2
SO
4
/H
3
PO
4
终止。随后加入50Ll9%A2异亚
硝基苯丙酮(A2isonitrosopropiophenone),95e温
育30min;540nm波长检测吸光度(D值),以尿
素(Urea)建立标准曲线。
2024年4月9日发(作者：关正真)
5现代免疫学62008年第28卷第3期
#177#
M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析
李 康,郭 强,王翠妮,陈 敏,徐 薇
,熊思东
(复旦大学免疫生物学研究所,复旦大学上海医学院免疫学系上海200032)
摘要:通过对M1和M2型巨噬细胞表型相关指标的比较分析,评价各鉴定巨噬细胞类型的表型指标及其意义。按常规方
法以IFN2C及LPS将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞,以IL24诱导出M2型巨噬细胞。分别以RT2PCR和酶活性
定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性;以ELISA检测IL212和IL210的分泌;以FACS检测巨噬细胞膜分子的表
达。结果显示:M1型巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)表达和活性水平较未刺激组明显
升高,IL212产生显著增加,CD16/32表达上调;而M2型巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase1,Arg21)的表达水平和酶活性
较未刺激巨噬细胞显著提高,IL210分泌轻度增加,并且表达高水平的CD206和DECTIN21。表型比较分析结果表明,iN2
OS表达和活性、IL212的分泌和膜蛋白CD16/32可用于鉴定M1型巨噬细胞,而Arg21、CD206和DECTIN21是鉴定M2
型巨噬细胞较为理想的表型指标。
关键词:M1型巨噬细胞;M2型巨噬细胞;表型分析
中图分类号:R392.12文献标识码:A文章编号:100122478(207
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巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞
群体,在体内外不同的微环境影响下,表现出明显
的功能差异
[1,2]
。目前根据活化状态和发挥功能的
不同,巨噬细胞主要可分为M1型即经典活化的巨
噬细胞(classicallyactivatedmacrophage),和M2
型即替代性活化的巨噬细胞(alternativelyactivated
macrophage)
[3,4]
。在体外培养条件下,通过IFN2C
及脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导产生M1
型巨噬细胞和通过Th2型细胞因子(如IL24、IL2
13等)诱导产生M2型巨噬细胞,具有与体内极化
的巨噬细胞相似的表型和功能,已成为研究巨噬细
胞异质性的重要手段。
在机体不同生理和疾病状态下,巨噬细胞表现
出不同的类型,通过表型分析鉴定巨噬细胞类型已
成为研究巨噬细胞功能多样性的主要方法。已有文
献主要从精氨酸代谢途径、细胞因子分泌
和表面分子的表达
[9,10]
等方面区分M1型与M2型
巨噬细胞。然而,到目前为止,关于M1和M2型
巨噬细胞的表型特征尚未统一。为了评价各种表型
收稿日期:2008202215
基金项目:新缰医科
作者简介:李 康(19832),男,硕士,主要从事巨噬细胞免疫调
节方面的研究。
通讯作者:熊思东(E2mail:sdxiongfd@);
#
指标及其意义,我们参照公认的经典的方法在体外
诱导了M1型和M2型巨噬细胞,对M1和M2表
型相关指标进行检测,进而相对量化地比较各表型
指标,以期为体内外鉴定巨噬细胞类型时表型指标
的选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠(H22
b
、4~6周
龄,雌性),体重16~20g,购自上海斯莱克实验
动物有限公司。清洁级饲养于复旦大学实验动物科
学部。
1.1.2 主要试剂 细胞培养基RPMI1640(Gibco
BRL公司),小牛血清(GibcoBRL公司),L2谷氨
酰胺(L2Glutamine)(政翔化学试剂研究所),双抗
(氨卞青霉素钠、硫酸链霉素)(上海第四制药厂),
胰酶(华美生物工程公司);小鼠重组IFN2C(Pep2
rotech公司),LPS(Sigma公司),小鼠重组IL24
(Peprotech公司);TaqDNA多聚酶、dNTP等
PCR试剂(Biostar公司),TRIzol(北京鼎国生物公
司),DEPC(Genetimes公司),M2MuLVReverse
Transcriptase(MBI公司);A2异亚硝基苯丙酮(A2
isonitrosopropiophenone)(Sigma公司),Arginine
(鼎国生物技术有限责任公司),NO检测试剂盒
(Cayman公司);小鼠IL210ELISA检测试剂盒
[5,6][7,8]
共同通讯作者
#178#
5现代免疫学62008年第28卷第3期
(eBioscience公司),小鼠IL212ELISA检测试剂
盒(eBioscience公司);FITC标记的大鼠抗小鼠
F4/80抗体(CALTAGLaboratories公司),PE标
记的驴抗大鼠IgG(H+L)抗体(eBioscience公
司),PE标记的抗小鼠CD16/32(FcCIII/FcCII受
体,2.4G2)抗体(BDPharmingen公司),未标记
大鼠抗小鼠CD206抗体(Serotec公司),未标记大
鼠抗小鼠MGL抗体由荷兰Erasmus医学中心Pi2
eterLeenen教授惠赠,未标记大鼠抗小鼠DEC2
TIN21抗体由南非CapeTown大学GordonBrown
教授惠赠。
1.1.3 引物 由北京赛百盛公司合成,本实验所
用引物见表1。
表1 引物序列
基因
iNOS
引物序列(F:正义链R:反义链)PCR片段(bp)
311
退火温度(e)
59
F:52CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG
R:52GGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA
F:52CAGAAGAATGGAAGAGTCAG
R:52CAGATATGCAGGGAGTCACC
F:52CTGCACCACCAACTGCTTAG
R:52GTCTGGGATGGAAATTGTGA
Arg2125059
GAPDH66056
1.2 方法
1.2.1 骨髓来源巨噬细胞的诱导 改进的Vats
等
[11]
的方法,将小鼠颈椎脱臼处死后,无菌分离
股骨和胫骨,用无菌2.5ml注射器吸入L929条件
培养基(含有20%小鼠成纤维细胞株L929培养3d
的上清、20%小牛血清、100U/ml青霉素、100
mg/ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培
养液),吹下骨髓内容物入一无菌平皿,并将细胞
充分吹匀,在L929条件培养基中培养,7d后去
除非贴壁细胞,再培养于完全RPMI1640培养基
(含10%小牛血清、1000U/ml青霉素、100mg/
ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺)中,1d后收集
的贴壁细胞即为骨髓来源的巨噬细胞。
1.2.2 巨噬细胞的体外刺激 以0.25%胰蛋白酶
消化收集诱导成熟的巨噬细胞,根据各实验要求铺
于24孔或6孔细胞培养板中,参照Vats等的
方法,以IFN2C(100U/ml)和LPS(5ng/ml)共同
刺激培养24~96h,诱导出M1型巨噬细胞;参照
Odegaard等
的方法,以IL24(10ng/ml)刺激
培养24~96h诱导出M2型巨噬细胞。
1.2.3 总RNA抽提及RT2PCR 提取方法参照
试剂盒说明书进行,向刺激24h的细胞(约1@
10)中加入1000LlTRIzol,立即用1ml注射器
抽打5次;然后加入200Ll氯仿,混匀,室温静
置15min后12000@g高速低温离心20min;小
心将上层水相移至1.5ml离心管中加入500Ll异
丙醇,振荡混匀。220e放置30min沉淀RNA,
12000@g高速低温离心10min;小心弃去上清,
6
[10]
[11]
再在离心管中加入1ml75%乙醇,振荡片刻,8
000@g低温离心5min;小心弃去上清,室温静置
5~10min使RNA沉淀恰好干燥,加水溶解。将
TRIzol抽提的细胞总RNA,以逆转录进行cDNA
第一链的合成:1~5Lg总RNA中加1LlOligo
(dT)
15
,70e5min,于冰上加入5@缓冲液3
Ll,dNTP2Ll,RNasin0.5Ll,逆转录酶200
U,加水至总体积15Ll,42e延伸60min后,70
e10min。然后以cDNA为模板扩增iNOS和Arg2
1的基因编码片段,以鼠GAPDH为内参照,扩增
条件如下:94e预变性5min;94e变性30s,
59e退火30s,72e延伸30s,30个循环;72e
延伸10min。
1.2.4 iNOS活性测定 收集刺激后24h的培养
上清,按照NO检测试剂盒(硝酸还原酶法)操作说
明,取200Ll培养上清,加入100LlGriessRea2
gentR1,再加入等体积GriessReagentR2,混匀
室温静置10min,于540nm处检测各样品吸光度
(D值),以亚硝酸钠(NaNO
2
)建立标准曲线。
1.2.5 Arg21活性测定 参照Lumeng等
[8]
的方
法,以100Ll0.1%TritonX2100裂解刺激48h
后的细胞,加入100Ll50mmol/LTris2HCl和10
mmol/LMnCl
2
,56e温育10min,加入100Ll
0.5mol/LArginine,37e温育30min,加入800
LlH
2
SO
4
/H
3
PO
4
终止。随后加入50Ll9%A2异亚
硝基苯丙酮(A2isonitrosopropiophenone),95e温
育30min;540nm波长检测吸光度(D值),以尿
素(Urea)建立标准曲线。