2024年6月2日发(作者：藤浩然)
旗开得胜
酵母单杂载体构建及实验流程（ZZY, 2016）
一、 载体构建
1.转录因子连接到pB42AD上。
测序引物如下：
pB42AD-2-F: GACTGGCTGAAATCGAATG
pB42AD-2-R: CAACAACGTATCTACCAACGA
2.启动子连接到pLACZi2μ上。
测序引物如下：
pLACZi2μ-F: ATGCTTCCTTCAGCACTACC
pLACZi2μ-R: ATTTATGCTACAAAGGACCTAATG
3.所选酵母菌株：EGY48
二、 转化步骤
酵母感受态细胞的制备：
1．酵母EGY48平板划线，活化，30℃ 培养 2-4 天。
2． 挑选直径在 2-3mm的酵母菌落，接种到3 ml YPD培养基中，30℃，225-250rpm，8-12h。
3． 在 250ml 烧瓶中加入 50ml 培养基，并加入 500ui-1ml 酵母菌液；30℃，225-250rpm，培养稀释过的
菌液 18-24h；
4 检测 OD600 值， OD600=1.2 ，大于 1.2 时，加入培养基稀释重摇，小于 1.2 时，培养 1-2h 再检测，
超过 24h 仍然小于 1.2 时，重新摇菌；
5 在 1L 的烧瓶中添加 300ml 培养基，然后吸取 50ml 的酵母菌液加入，30℃培养 3h，225-250rpm；
6 在 5000rpm 下离心 5min，常温下获取细胞；
7 除去上清液，用 50ml 的去离子水重新旋起细胞；
1
读万卷书 行万里路
旗开得胜
8 在室温 5000rpm 离心 5min 细胞液；
9 除去上清，并用 1.5mlTE-LiAC 溶液旋起细胞；可以按50ul每管分装，4℃避光保存，10天内可以直接转化
使用。
感受态细胞的转化：
1 carrierDNA 制备，水浴煮沸 carrierDNA 20min,迅速放置在冰上冷却；
2.在1.5ml无菌离心管中按以下顺序加入:
转录因子 200ng
启动子 200ng
carrierDNA 20ul
混匀后加入50ul 感受态细胞，轻轻混匀。
3.加入500ul 的 TE-LiAc-PEG 溶液到每个离心管中，并涡旋混匀
4. 30℃，200rpm，培养30min。
5. 每管中添加 55ul 的 DMSO，慢慢混匀；
6. 42℃水浴条件下热激样品 15min，其中每隔5min轻轻混匀一次。
7. 将样品放置在冰上 2min ;
8. 12000rpm 离心样品 15s，收集细胞，去除上清。
9. 加入1ml YPD 培养液，30℃，200rpm，培养60min.
10. 12000rpm 离心样品 15s，收集细胞，去除上清。
11 添加 1ml 1XTE buffer，并涡旋使细胞重悬，如果除去上清时使细胞重悬，则需要用直径较大的枪头，降
低吸液的压力。（可以重复几遍，清洗多余的 DMSO）
12 用直径较大的枪头将细胞液加到选择培养基上（SD-U-T）。在每板加入 50ul 细胞液 。
13. 在 30℃条件下培养平板 2-4 天.
相关试剂配方：
YPD 培养基配制 (1L，pH 5.8)
1
读万卷书 行万里路
1 L 500 ml 250 ml
酵母提取物 10g 5g 2.5g
蛋白胨 20g 10g 5g
H2O 950ml 475ml 237.5ml
调pH至5.8g，加入20g Agar，高压灭菌121℃，15min, 再加入以下试剂
40% Glucose 50ml 25ml 12.5ml
SD-Ura-Trp plates 制备：(1L，pH 5.8)
1 L 500 ml 250 ml
Yeast Nitrogen 6.7g 3.35g 1.675g
Base
SD-Ura-Trp 0.72g 0.36g 0.18g
H2O 950ml 475ml 237.5ml
调pH至5.8g，加入20g Agar，高压灭菌121℃，15min, 再加入以下试剂
40% Glucose 50ml 25ml 12.5ml
SD/Gal/Raf -Ura-Trp +X-gal plates 制备：
1 L 500 ml 250 ml
Yeast Nitrogen 6.7g 3.35g 1.675g
Base
SD-Ura-Trp 0.72g 0.36g 0.18g
H2O 825ml 412.5ml 206.25ml
读万卷书 行万里路
旗开得胜
1
2024年6月2日发(作者：藤浩然)
旗开得胜
酵母单杂载体构建及实验流程（ZZY, 2016）
一、 载体构建
1.转录因子连接到pB42AD上。
测序引物如下：
pB42AD-2-F: GACTGGCTGAAATCGAATG
pB42AD-2-R: CAACAACGTATCTACCAACGA
2.启动子连接到pLACZi2μ上。
测序引物如下：
pLACZi2μ-F: ATGCTTCCTTCAGCACTACC
pLACZi2μ-R: ATTTATGCTACAAAGGACCTAATG
3.所选酵母菌株：EGY48
二、 转化步骤
酵母感受态细胞的制备：
1．酵母EGY48平板划线，活化，30℃ 培养 2-4 天。
2． 挑选直径在 2-3mm的酵母菌落，接种到3 ml YPD培养基中，30℃，225-250rpm，8-12h。
3． 在 250ml 烧瓶中加入 50ml 培养基，并加入 500ui-1ml 酵母菌液；30℃，225-250rpm，培养稀释过的
菌液 18-24h；
4 检测 OD600 值， OD600=1.2 ，大于 1.2 时，加入培养基稀释重摇，小于 1.2 时，培养 1-2h 再检测，
超过 24h 仍然小于 1.2 时，重新摇菌；
5 在 1L 的烧瓶中添加 300ml 培养基，然后吸取 50ml 的酵母菌液加入，30℃培养 3h，225-250rpm；
6 在 5000rpm 下离心 5min，常温下获取细胞；
7 除去上清液，用 50ml 的去离子水重新旋起细胞；
1
读万卷书 行万里路
旗开得胜
8 在室温 5000rpm 离心 5min 细胞液；
9 除去上清，并用 1.5mlTE-LiAC 溶液旋起细胞；可以按50ul每管分装，4℃避光保存，10天内可以直接转化
使用。
感受态细胞的转化：
1 carrierDNA 制备，水浴煮沸 carrierDNA 20min,迅速放置在冰上冷却；
2.在1.5ml无菌离心管中按以下顺序加入:
转录因子 200ng
启动子 200ng
carrierDNA 20ul
混匀后加入50ul 感受态细胞，轻轻混匀。
3.加入500ul 的 TE-LiAc-PEG 溶液到每个离心管中，并涡旋混匀
4. 30℃，200rpm，培养30min。
5. 每管中添加 55ul 的 DMSO，慢慢混匀；
6. 42℃水浴条件下热激样品 15min，其中每隔5min轻轻混匀一次。
7. 将样品放置在冰上 2min ;
8. 12000rpm 离心样品 15s，收集细胞，去除上清。
9. 加入1ml YPD 培养液，30℃，200rpm，培养60min.
10. 12000rpm 离心样品 15s，收集细胞，去除上清。
11 添加 1ml 1XTE buffer，并涡旋使细胞重悬，如果除去上清时使细胞重悬，则需要用直径较大的枪头，降
低吸液的压力。（可以重复几遍，清洗多余的 DMSO）
12 用直径较大的枪头将细胞液加到选择培养基上（SD-U-T）。在每板加入 50ul 细胞液 。
13. 在 30℃条件下培养平板 2-4 天.
相关试剂配方：
YPD 培养基配制 (1L，pH 5.8)
1
读万卷书 行万里路
1 L 500 ml 250 ml
酵母提取物 10g 5g 2.5g
蛋白胨 20g 10g 5g
H2O 950ml 475ml 237.5ml
调pH至5.8g，加入20g Agar，高压灭菌121℃，15min, 再加入以下试剂
40% Glucose 50ml 25ml 12.5ml
SD-Ura-Trp plates 制备：(1L，pH 5.8)
1 L 500 ml 250 ml
Yeast Nitrogen 6.7g 3.35g 1.675g
Base
SD-Ura-Trp 0.72g 0.36g 0.18g
H2O 950ml 475ml 237.5ml
调pH至5.8g，加入20g Agar，高压灭菌121℃，15min, 再加入以下试剂
40% Glucose 50ml 25ml 12.5ml
SD/Gal/Raf -Ura-Trp +X-gal plates 制备：
1 L 500 ml 250 ml
Yeast Nitrogen 6.7g 3.35g 1.675g
Base
SD-Ura-Trp 0.72g 0.36g 0.18g
H2O 825ml 412.5ml 206.25ml
读万卷书 行万里路
旗开得胜
1