2024年6月12日发(作者：望君昊)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.6
(22)申请日 2011.09.13
(71)申请人 暨南大学
地址 510632 广东省广州市黄埔大道西601号
(72)发明人 陈填烽 郑文杰 蒋洁 杨芳 黄家兴
(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有限公司
代理人 裘晖
(51)
C07K14/405
C07K1/36
C07K1/34
C07K1/30
C07K1/16
(10)申请公布号 CN 102329381 A
(43)申请公布日 2012.01.25
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻
蓝蛋白的方法与应用
(57)摘要
本发明公开一种同时分离高纯度的
藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用。本
发明将螺旋藻干粉反复冻融，超声破碎，
离心，上清为藻胆蛋白粗提液；接着加入
硫酸铵，饱和度为25～35％时取上清；再
加入硫酸铵，饱和度为60～70％时取沉
淀，透析沉淀，得到初步纯化的藻胆蛋白
提取液，将其上样到羟基磷灰石柱子；收
集含0.1～0.2M氯化钠的pH6.5～7.2、
0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶液和含0.1～
0.2M氯化钠的pH6.5～7.2、0.1～0.12M磷
酸盐缓冲溶液，前者为藻蓝蛋白，后者为
别藻蓝蛋白。该制备方法能同时获得纯化
因子达到4.5的藻蓝蛋白和3的别藻蓝蛋白
及其含硒、碲类似物，并对其纯化规模进
行放大，一次层析可获得克级的高纯度蛋
白，大大降低纯化成本，能用于生产藻蓝
蛋白和别藻蓝蛋白。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，其特征在于包含
(1)将螺旋藻干粉溶于磷酸盐缓冲溶液中，反复冻融，超声破碎，离心，
(2)使用硫酸铵盐析法初步纯化藻胆蛋白粗提液，具体如下：0℃下加入
上清为藻胆蛋白粗提液；
以下步骤：
饱和度为25～35％的硫酸铵溶液盐析去除杂蛋白，得到的上清液用0℃下饱
为60～70％的硫酸铵溶液盐析，得到的沉淀用磷酸盐缓冲溶
袋中，于磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，将透析液
的藻胆蛋白提取液；
和度
液溶解并置于透析
离心，取上清，得到初步纯化
(3)羟基磷灰石的制备、装柱及平衡：将氯化钙和磷酸氢二钾按摩尔比1∶1
以相同的速度匀速滴入装有相同浓度的氯化钙溶液中；滴加完毕后，静置沉
倾去上清液，沉淀用水冲洗；接着用氢氧化钾溶液调节沉淀的
24小时后，用水冲洗沉淀，弃去细小颗粒，装
淀，
pH＞8，放置12～
柱，然后用磷酸盐缓冲溶液平衡；
(4)将步骤(2)得到的初步纯化的藻胆蛋白提取液上样到步骤(3)制备
含
的平衡后的羟基磷灰石柱子，上样量为柱床体积的1/3～1/2；上样完毕后用
0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗
为0.005～0.01M、0.02～0.03M、0.04～0.06M
脱，洗脱梯度分别
和0.1～0.12M；
(5)收集含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶
液和含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.1～0.12M磷酸盐缓冲溶液，前
者为
藻蓝蛋白，后者为别藻蓝蛋白；分别进行冷冻干燥，保存；
步骤(1)～(3)中所述的磷酸盐缓冲溶液为0.5～10mM、pH 6.5～7.2的
2.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
其特征在于：步骤(1)中所述的冻融的次数为5～10次，冻融的操作步骤为-
-10℃冷冻结冰，10～15℃融化完全。
磷酸盐缓冲溶液。
20～
3.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
4.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
5.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
其特征在于：步骤(2)中所述的透析袋的规格为截留量10KDa。
其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的离心的条件为10000～13000r/min
离心30～60min。
其特征在于：步骤(1)中所述的超声破碎的条件为150～250W、15～60min。
6.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
7.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
8.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
步骤(5)中得到的藻蓝蛋白的纯化因子大于4.5；
步骤(5)中得到的别藻蓝蛋白的纯化因子大于3.0。
9.权利要求1～8任一项所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
白
其特征在于：
其特征在于：步骤(3)中所述的平衡的次数为3～5次。
其特征在于：步骤(3)中所述的装柱的柱子的规格为1.5cm×20cm的具活塞
层析柱。
的方法的应用，其特征在于：所述的方法用于对各类含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋
的蓝藻、细菌及其市售干粉分离得到藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。
10.根据权利要求9同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法的应
所述的藻蓝蛋白为含硒和/或碲的藻蓝蛋白；
所述的别藻蓝蛋白为含硒和/或碲的别藻蓝蛋白。
用，其特征在于：
说 明 书
技术领域
本发明属于保健品、功能食品和生物医药领域，具体的说涉及一种同时分
背景技术
进入21世纪，世界范围内形成了开发海洋湖沼资源的热潮，海洋药物的开
发有着巨大的发展潜力。其中，广泛、大量存在于藻类藻胆体中的藻胆蛋白，
由于其安全无毒、具有多方面的开发应用价值和较高的生物活性，而
少学者的关注。藻胆蛋白为一类色素复合蛋白，根据其吸收光
蓝蛋白(Phycocyanins，PC)、别藻蓝蛋白
(Phycoerythrin，PE)和藻红蓝蛋白
可作为天然色素广泛应用于
荧光所制成的荧光试
化学及生物工
促进动
离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用。
引起了不
谱性质可分为藻
(Allophycocyanins，APC)、藻红蛋白
(Phycoerythrocyanin，PEC)。藻胆蛋白不仅
食品、化妆品、染料等工业，而且由于其具有强烈
剂、荧光探针、荧光示踪物质等用于临床医学诊断、免疫
程等研究领域中，具有明显抗氧化、抗炎症、提高机体免疫力、
物细胞再生、抑致癌细胞的作用等生物活性(Farooq et al，Chem-Biol
Interact，2004，149，1-7；Subhashini et al，Biochem Pharmacol，2004，68：
Chen and Wong，J Agric Food Chem，2008，56，4352-4358)。
明藻胆蛋白具有良好的应用开发前景。
453-62；
已有的研究结果均表
目前，关于藻胆蛋白的提取工艺研究相对落后，且产物稳定性较低，极大
择
的限制了其工业化生产的发展。对于藻胆蛋白的粗提取，细胞破碎方法的选
是关键步骤。目前国内外基本采用采用反复冻融法、超声波破碎法、
物理破碎、酶溶法、化学渗透法和十二烷基苯磺酸钠裂解法等
胞(Santiago-Santos et al，Process Biochem，2004，39，
匀浆法、
方法来破碎藻细
2047-2052)。其中以反复 冻融-超声破碎联用法使用最为广泛，破碎效果
产品，更适合于规模化开发。但要进一步
必须通过柱层析等其他方法处理。
丙酮沉淀。在纯化技术上，
好，可获得大量的藻胆蛋白粗
分离纯化得到藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
关于蛋白沉淀都普遍使用硫酸胺盐析或冷冻
目前使用的有离子交换色谱和体积排阻色谱法(Chen
and Wong，Phytochemistry，2006，67，2424-2430.)、膨胀床吸附色谱
Chromatogr B，2007，850：267-276.)、疏水性相互作用色谱
谱和体积排阻色谱单独使用或串联使用是常用的
蛋白的纯化方法，但所需的填料昂贵，且
白。近来有研究人员采用双水相萃
and Raghavarao，
有待进
(Niu et al，J
等。其中，离子交换色
也是首选的分离螺旋藻中藻蓝
不能一次性分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋
取方法多次萃取得到纯化的藻蓝蛋白(Pail G
Biochem Eng J，2007，34：156-164)，但该技术目前仍不够成熟，
一步优化。专利号为2.X、名称为“同时制备藻蓝蛋白和别
制
藻蓝蛋白的方法”的国家发明专利提供了一种采用羟基磷灰石柱层析法同时
备藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，但所得产品纯度仅为2.1，无法达
领域的使用要求。因此，如何快速有效的同时分离高纯度藻蓝
白成为人们关注的焦点和努力的方向。
到生物医药
蛋白和别藻蓝蛋
目前有研究表明含硒、碲藻蓝蛋白在抗氧化、抗肿瘤等生物活性方面的表
现优于普通藻蓝蛋白(Chen and Wong，J Agric Food Chem，2008，56：
4358)，因此，如何分离纯化含硒、碲的藻胆蛋白类似物也具有重要
4352-
意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种同时分离高
纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法。
本发明的另一目的在于提供所述同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和
(1)将螺旋藻干粉溶于磷酸盐缓冲溶液中，反复冻融，超声破碎，离心，
(2)使用硫酸铵盐析法初步纯化藻胆蛋白粗提液，具体如下：0℃下加入
饱和度为25～35％的硫酸铵溶液盐析去除杂蛋白，得到的上清液用0℃下饱
为60～70％的硫酸铵溶液盐析，得到的沉淀用磷酸盐缓冲溶液溶解
袋中，于磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，将透析液离心，取上清，
的藻胆蛋白提取液；
上清为藻胆蛋白粗提液；
别藻蓝蛋白的方法，包含以下步骤：
的方法的应用。
和度
并置于透析
得到初步纯化
(3)羟基磷灰石的制备、装柱及平衡：将氯化钙和磷酸氢二钾按摩尔比1∶1
以相同的速度匀速滴入装有相同浓度的氯化钙溶液中；滴加完毕后，静置沉
倾去上清液，沉淀用水冲洗；接着用氢氧化钾溶液调节沉淀的pH＞8，
24小时后，用水冲洗沉淀，弃去
本优化方法制备的羟
买的颗粒太小
淀，
放置12～
细小颗粒，装柱，然后用磷酸盐缓冲溶液平衡；
基磷灰石颗粒大小适中，可达到较好的分离效果，市面上
会严重影响洗脱速度，甚至导致无法洗脱；
(4)将步骤(2)得到的初步纯化的藻胆蛋白提取液上样到步骤(3)制备 的平衡
后的羟基磷灰石柱子，上样量为柱床体积的1/3～1/2；上样完毕后用含
0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度
为0.005～0.01M、0.02～0.03M、0.04～0.06M和0.1～0.12M； 分别
(5)收集含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶
步骤(1)～(3)中所述的磷酸盐缓冲溶液为0.5～10mM、pH 6.5～7.2的
缓冲溶液；
步骤(1)中所述的冻融的次数优选为5～10次，冻融的操作步骤优选为-20～
步骤(1)中所述的超声破碎的频率优选为150～250W，时间优选为15～
步骤(1)中所述的离心的条件优选为10000～13000r/min离心30～60min；
步骤(2)中所述的硫酸铵溶液盐析的百分比均指硫酸铵溶液在0℃时的饱
步骤(2)中所述的透析袋的规格优选为截留量为10KDa；
步骤(2)中所述的离心的条件优选为10000～13000r/min离心30～60min；
步骤(3)中所述的装柱的柱子的规格优选为1.5cm×20cm的具活塞层析
步骤(3)中所述的平衡的次数优选为3～5次；
柱；
离心的目的为除去透析液中的变性蛋白；
和度；
60min；
-10℃冷冻结冰，10～15℃融化完全；
磷酸盐
液(即藻蓝蛋白)和含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.1～0.12M磷酸盐缓
冲溶液(即别藻蓝蛋白)，进行冷冻干燥，保存。
步骤(5)中得到的藻蓝蛋白的纯化因子(A620/A280)大于4.5；
步骤(5)中得到的别藻蓝蛋白的纯化因子(A650/A280)大于
3.0；
所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法可广泛用于各类含
藻
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用反复冻融——超声破碎联用法、硫酸铵分级沉降和羟基磷
灰石柱层析法配合使用，同时获得纯化因子达到4.5的藻蓝蛋白和3的别藻
白及其含硒、碲类似物，并对其纯化规模进行放大，一次层析可获得
纯度蛋白，大大降低纯化成本。按照目前的技术计算，每毫克
民币，远低于SIGMA公司的价格(100美元/毫克)，未
价格仍可大大降低，这为其进一步的工业化生产
泛用于各类含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的蓝
碲的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离
白、别藻蓝蛋白及其含硒、
前景非常广阔，经济
藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的蓝藻、细菌及其市售干粉，分离得到藻蓝蛋白和别
蓝蛋白，还可用于分离含硒、碲的藻蓝蛋白和含硒、碲的别藻蓝蛋白。
蓝蛋
克级的高
成本低于10元人
来随着技术的优化，此
打下基础。同时，此方法可广
藻、细菌及其市售干粉，且对于含硒、
同样适用，是一次性快速分离高纯度藻蓝蛋
碲类似物的通用方法。因此，该研究项目的产业化
社会效益显着。
(2)本发明所述的方法具有成本低廉、工艺简单、条件温和、环境友好，
便于进行大规模工业化生产等优点。
(3)本发明提供制备藻胆蛋白粗提液的通用方法，简便高效，对自配养的
的
附图说明
图1是实施例1中的羟基磷灰石柱层析分离藻胆蛋白的洗脱曲线图。
图2是实施例1得到的藻蓝蛋白(PC)与别藻蓝蛋白(APC)的紫外可见
图3是实施例2中的羟基磷灰石柱层析分离含硒藻胆蛋白的洗脱曲线图。
图4是实施例2中的羟基磷灰石柱层析分离含碲藻胆蛋白的洗脱曲线图。
图5是藻蓝蛋白及其含硒、碲类似物的SDS-PAGE电泳分离图，其中：
泳道M为Marker；泳道1为实施例1制备的藻蓝蛋白；泳道2为实施例2
图6是别藻蓝蛋白及其含硒、碲类似物的SDS-PAGE电泳分离图，其中：
泳道M为Marker；泳道1为实施例1制备的别藻蓝蛋白；泳道2为实施例
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式
2制备的含硒的别藻蓝蛋白；泳道3为实施例2制备的含碲的别藻蓝蛋白。
制备的含硒的藻蓝蛋白；泳道3为实施例2制备的含碲的藻蓝蛋白。
光谱图。
各种蓝藻、鲜活细菌，及其市售干粉均适用，降低对原料的要求，便于方法
推广。
不限于此。
实施例1藻蓝蛋白及别藻蓝蛋白的分离纯化
(1)羟基磷灰石的制备：
将0.4M氯化钙和0.4M磷酸氢二钾500mL均分别以5ml/min的速度滴加
置
到装有200ml浓度为0.4M的氯化钙溶液的烧杯中，不断搅拌。完毕后，静
沉淀，倾去上清液，用足够的自来水冲洗。一边向沉淀中加入2M的
一边搅拌，确保沉淀pH＞8，放置12h后，用大量自来水冲洗，
装入规格为1.5cm×20cm的具活塞层析柱中。然后用
液(pH＝6.8)平衡3-5次即可，其中羟基磷灰石沉
(pH＝6.8)体积比约为1∶1。
氢氧化钾，
弃去细小颗粒，
0.001M磷酸盐缓冲溶
淀和1mM磷酸盐缓冲溶液
(2)羟基磷灰石柱层析法分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
①藻胆蛋白粗提液的制备：取商业来源的螺旋藻粉或自培养螺旋藻。自培
养螺旋藻的培养方法如下：在三角烧瓶中加入Zarrouk培养液，接种螺旋藻
节藻的初始A560＝0.20(于光照培养箱中培养，温度
照强度为72μmol·m-2·s-
pH＝6.8的磷
冻融(-
并调
(30±2)℃，pH 8～9，光
1；培养至11d采收，用400目的纱绢过滤)于1mM、
酸盐缓冲液溶液中，控制其比值为1g藻：10ml溶液，混匀后反复
20℃冷冻结冰后置于10℃的水中完全解冻)5次，超声破碎15～60min，
②硫酸铵分级沉降：0℃下，向藻胆蛋白粗提液中加入硫酸铵固体配成饱和
度为30％的硫酸铵溶液，盐析60min后10000r/min，30min高速离心，保留
功率200W。10000r/min，高速离心60min，上清液为藻胆蛋白粗提液。
上 清液，弃去沉淀。上清液用饱和度为65％硫酸铵溶液盐析、离心后，
液，向沉淀中加入少量1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲液溶解
KDa的透析袋中，于1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶
r/min，60min高速离心除去变性蛋白，得到初步
弃去上清
并置于接流量为10
液中透析过夜后，10000
纯化后的藻胆蛋白溶液。
③装柱及平衡：将羟基磷灰石混合液摇匀，玻棒引流于层析柱中，敲击层
为
析柱以确保填装均匀紧实。将上述初步纯化后的藻胆蛋白溶液上柱，上样量
柱床体积的1/3，待其被羟基磷灰石完全吸附后，开始洗脱，选用含
钠的不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)作为洗脱液，控制
分别为0.005、0.020、0.050、0.100M，流速为
藻蓝蛋白、混与别藻蓝蛋白中的藻蓝蛋白
离藻胆蛋白的洗脱曲线如图1所示，
组分3为藻蓝蛋白与别藻蓝
0.2M氯化
梯度洗脱的浓度
0.8ml/min，依次洗脱出杂蛋白、
和别藻蓝蛋白。羟基磷灰石柱层析分
其中组分1为杂蛋白，组分2为藻蓝蛋白，
蛋白混合物，组分4为别藻蓝蛋白。
④收集及保存：分别收集藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，并冷冻干燥得干粉保存
⑤光谱表征：分别对藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白进行光谱扫描(如图2所示)，
测定其纯度分别为A620/A280＞4.5，
于-20℃。
A650/A280＞3.0。
实施例2含硒藻蓝蛋白及含硒别藻蓝蛋白的分离纯化
羟基磷灰石的制备步骤与上同。通过如下步骤分离制备含硒藻蓝蛋白和含
硒别藻蓝蛋白：
(1)藻胆蛋白粗提液的制备：取商业来源或者自培养的富硒培养螺旋藻。
自培养富硒螺旋藻培养方法如下：在三角烧瓶中加入Zarrouk培养液，接种
藻并调节藻的初始A560＝0.20(于光照培养箱中培养，温
9，光照强度为72μmol·m-2·s-1；
次为100、150、
螺旋
度(30±1)℃，pH 8～
分别在7～9d添加亚硒酸钠，以硒浓度计量依
200mg·L-1，从第7天开始每隔24小时添加累计加硒量为450
mg·L-1；培养至11d采收，用400目的纱绢过滤)于1mM、pH
冲液溶液中，控制其比值为1g藻：10ml溶液，混匀后
冰后置于10℃完全解冻)5次，超声破碎10min，
60min高速离心，上清液为含硒藻胆蛋白粗提液。
＝6.8的磷酸盐缓
反复冻融(-20℃冷冻结
功率200W。10000r/min，
(2)硫酸铵分级沉降：0℃下，向藻胆蛋白粗提液中加入硫酸铵固体配成
留
饱和度为30％硫酸铵溶液，盐析60min后10000r/min，30min高速离心，保
上清液，弃去沉淀。上清液用饱和度为65％硫酸铵溶液盐析、离心
清液，向沉淀中加入少量1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲液溶
10KDa的透析袋中，于1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲
r/min，60min高速离心除去变性蛋白，得到初步
后，弃去上
解并置于接流量为
溶液中透析过夜后，10000
纯化后的藻胆蛋白溶液。
(3)装柱及平衡：将羟基磷灰石混合液摇匀，玻棒引流于层析柱中，敲击
上
层析柱以确保填装均匀紧实。将上述初步纯化后的含硒藻胆蛋白溶液上柱，
样量为柱床体积的1/3，待其被羟基磷灰石完全吸附后，开始洗脱，
氯化钠的不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)作为洗脱液，
浓度分别为0.005、0.020、0.050、0.100M，流速为
白(如图3组分1所示)、含硒藻蓝蛋白(如
与别藻蓝蛋白混合物(如图3组分3所示)、
示)。
选用含0.2M
控制梯度洗脱的
0.8ml/min，依次洗脱出杂蛋
图3组分2所示)、含硒藻蓝蛋白
含硒别藻蓝蛋白(如图3组分4所
(4)收集及保存：分别收集含硒藻蓝蛋白和含硒别藻蓝蛋白，并冷冻干燥
(5)光谱表征及硒含量测定：分别对含硒藻蓝蛋白和含硒别藻蓝蛋白进行
光谱扫描，测定其纯度分别为A620/A280＞4.5，
离子体原子发
得干粉保存于-20℃。
A650/A280＞3.0。通过电感耦合等
射光谱(ICP-AES)法测得两种藻胆蛋白的硒含量分别为496.5和
实施例3含碲的藻蓝蛋白及别藻蓝蛋白的分离纯化
羟基磷灰石的制备步骤与上同。通过如下步骤分离制备含碲藻蓝蛋白和别
(1)藻胆蛋白粗提液的制备：取商业来源的螺旋藻粉或自培养螺旋藻。富
碲螺旋藻的培养方法如下：在三角烧瓶中加入Zarrouk培养液，接种
并调节藻的初始A560＝0.20(于光照培养箱中培养，
9，光照强度为72μmol·m-2·s-
次为200、
藻蓝蛋白：
589.5μg/g protein。
sis
温度(30±2)℃，pH＝8～
1；分别在7～9d添加亚碲酸钠，以碲浓度计量依
250、250mg·L-1，从第7天开始每隔24小时添加，累计加碲量为700
mg·L-1；培养至11d采收，用400目的纱绢过滤。)于1mM pH
冲液溶液中，控制其比值为1g藻：10ml溶液，混匀后
冰后置于10℃完全解冻)5次，超声破碎15～
60min高速离心，上清液为含碲藻胆蛋白
＝6.8的磷酸盐缓
反复冻融(-20℃冷冻结
60min，功率200W。10000r/min，
粗提液。
(2)硫酸铵分级沉降：0℃下，向藻胆蛋白粗提液中加入硫酸铵固体配成
留
饱和度为30％硫酸铵溶液，盐析60min后10000r/min，30min高速离心，保
上清液，弃去沉淀。上清液用饱和度为65％硫酸铵溶液盐析、离心
清液，向沉淀中加入少量1mM pH＝6.8的磷酸盐缓冲液溶解
KDa的透析袋中，于1mM pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液
60min高速离心除去变性蛋白，得到初步
后，弃去上
并置于接流量为10
中透析过夜后，10000r/min，
纯化后的藻胆蛋白溶液。
(3)装柱及平衡：将羟基磷灰石混合液摇匀，玻棒引流于层析柱中，敲击
上
层析柱以确保填装均匀紧实。将上述初步纯化后的含碲藻胆蛋白溶液上柱，
样量为柱床体积的1/3，待其被羟基磷灰石完全吸附后，开始洗脱，
氯化钠的不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)作为洗脱液，
浓度分别为0.005、0.020、0.050、0.100M，流速为
蛋白(如图4组分1所示)、含碲藻蓝蛋白(如图4
白与别藻蓝蛋白混合
所示)。
选用含0.2M
控制梯度洗脱的
0.8ml/min，依次洗脱出杂
组分2所示)、含碲藻蓝蛋
物(如图4组分3所示)、含碲别藻蓝蛋白(如图4组分4
(4)收集及保存：分别收集含碲藻蓝蛋白和含碲别藻蓝蛋白，并冷冻干燥
(5)光谱表征及碲含量测定：分别对含碲藻蓝蛋白和含碲别藻蓝蛋白进行
光谱扫描，测定其纯度分别为A620/A280＞4.5，
离子体原子发
得干粉保存于-20℃。
A650/A280＞3.0。通过电感耦合等
射光谱(ICP-AES)法测得两种藻胆蛋白的碲含量分别为611.1和
实施例4聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳及MALDI-TOF/MS鉴定
分离纯化的蛋白的纯度用SDS-PAGE进行确认，并同时对相应的亚基进行
625.3μg/g protein。
分离。实验采用Laemmli法的垂直不连续电泳系统，分离胶聚丙烯酰胺质
数为15％。加样量为40μg蛋白每孔，样品与等体积的SDS-样品缓
分质量分数为：2％的SDS，10％甘油，5％巯基乙醇、0.002％
pH6.8的Tris-HCl)混合，并在95℃煮5min，在室温下
马斯亮蓝染液进行染色。结果如图5和图6所示。
量分
冲液(各成
溴酚蓝和60mM
进行电泳，完成后用考
将分离出的蛋白条带从胶中挑出，切成碎片后进行胶内胰酶酶解过夜(参
考文献进行：Chen Tianfeng，Wong Yum-Shing，Zheng，
characterization of selenium-W.(2006)Purification and
为
containing phycocyanin from selenium-enriched
Spirulina hemistry.67，2424-2430)。酶解后的多肽用体积分数
5％的三氟乙酸-乙腈溶液超声辅助提取10分钟，提取液在SpeedVac
所得多肽样品用体积分数为0.1％的三氟乙酸-乙腈溶液
柱(Millipore)进行除盐富集，再用含0.1％三氟乙
液点样并进行基质辅助激光解吸-串联飞
使用仪器为
是一种
仪器上蒸干。
溶解，并用Zip Tip u-C18
酸的50％乙腈溶液洗脱，所得溶
行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)分析，
ABI Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer。MALDI-TOF-TOF
新兴、有效的蛋白质的鉴定技术，是目前蛋白质组研究中较为常用、准
确的分析方法。该技术可以提供肽质量指纹谱(Peptide mass fingerprinting，
及肽谱序列信息。通过比较蛋白酶解后得到的肽片断质量图谱对蛋白
定，以Protein Score＞60作为数据可信的鉴定标准。对本发明
藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白及其含硒、碲类似物的检测结果
PC、Se-PC、Te-PC和APC、Se-APC、Te-APC
No.和分子量，发现均无差异。这
PMF)
质进行鉴
实施例制备得到的
如表1所示，分别对比
三组蛋白的α、β亚基的Accession
是由于NCBI等蛋白数据库均不存在任何关于
含硒、碲蛋白的序列，因此含硒、碲蛋白被识别成了普通蛋白而具有相同的
Accession No.和分子量。但含硒、碲组和普通组的
identified peptide No.和Protein Score均存在差异，说明含硒、碲组和普
ICP-AES的结果可以证明硒、碲以通组蛋白在结构上存在差异，结合
成功结合到蛋白中。
表1、MALDI-TOF/MS鉴定藻蓝蛋白(PC)与别藻蓝蛋白(APC)及其含硒、碲类似物
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施
替
例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、
代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范
围之内。
2024年6月12日发(作者：望君昊)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.6
(22)申请日 2011.09.13
(71)申请人 暨南大学
地址 510632 广东省广州市黄埔大道西601号
(72)发明人 陈填烽 郑文杰 蒋洁 杨芳 黄家兴
(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有限公司
代理人 裘晖
(51)
C07K14/405
C07K1/36
C07K1/34
C07K1/30
C07K1/16
(10)申请公布号 CN 102329381 A
(43)申请公布日 2012.01.25
权利要求说明书 说明书 幅图
(54)发明名称
同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻
蓝蛋白的方法与应用
(57)摘要
本发明公开一种同时分离高纯度的
藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用。本
发明将螺旋藻干粉反复冻融，超声破碎，
离心，上清为藻胆蛋白粗提液；接着加入
硫酸铵，饱和度为25～35％时取上清；再
加入硫酸铵，饱和度为60～70％时取沉
淀，透析沉淀，得到初步纯化的藻胆蛋白
提取液，将其上样到羟基磷灰石柱子；收
集含0.1～0.2M氯化钠的pH6.5～7.2、
0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶液和含0.1～
0.2M氯化钠的pH6.5～7.2、0.1～0.12M磷
酸盐缓冲溶液，前者为藻蓝蛋白，后者为
别藻蓝蛋白。该制备方法能同时获得纯化
因子达到4.5的藻蓝蛋白和3的别藻蓝蛋白
及其含硒、碲类似物，并对其纯化规模进
行放大，一次层析可获得克级的高纯度蛋
白，大大降低纯化成本，能用于生产藻蓝
蛋白和别藻蓝蛋白。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，其特征在于包含
(1)将螺旋藻干粉溶于磷酸盐缓冲溶液中，反复冻融，超声破碎，离心，
(2)使用硫酸铵盐析法初步纯化藻胆蛋白粗提液，具体如下：0℃下加入
上清为藻胆蛋白粗提液；
以下步骤：
饱和度为25～35％的硫酸铵溶液盐析去除杂蛋白，得到的上清液用0℃下饱
为60～70％的硫酸铵溶液盐析，得到的沉淀用磷酸盐缓冲溶
袋中，于磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，将透析液
的藻胆蛋白提取液；
和度
液溶解并置于透析
离心，取上清，得到初步纯化
(3)羟基磷灰石的制备、装柱及平衡：将氯化钙和磷酸氢二钾按摩尔比1∶1
以相同的速度匀速滴入装有相同浓度的氯化钙溶液中；滴加完毕后，静置沉
倾去上清液，沉淀用水冲洗；接着用氢氧化钾溶液调节沉淀的
24小时后，用水冲洗沉淀，弃去细小颗粒，装
淀，
pH＞8，放置12～
柱，然后用磷酸盐缓冲溶液平衡；
(4)将步骤(2)得到的初步纯化的藻胆蛋白提取液上样到步骤(3)制备
含
的平衡后的羟基磷灰石柱子，上样量为柱床体积的1/3～1/2；上样完毕后用
0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗
为0.005～0.01M、0.02～0.03M、0.04～0.06M
脱，洗脱梯度分别
和0.1～0.12M；
(5)收集含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶
液和含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.1～0.12M磷酸盐缓冲溶液，前
者为
藻蓝蛋白，后者为别藻蓝蛋白；分别进行冷冻干燥，保存；
步骤(1)～(3)中所述的磷酸盐缓冲溶液为0.5～10mM、pH 6.5～7.2的
2.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
其特征在于：步骤(1)中所述的冻融的次数为5～10次，冻融的操作步骤为-
-10℃冷冻结冰，10～15℃融化完全。
磷酸盐缓冲溶液。
20～
3.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
4.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
5.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
其特征在于：步骤(2)中所述的透析袋的规格为截留量10KDa。
其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的离心的条件为10000～13000r/min
离心30～60min。
其特征在于：步骤(1)中所述的超声破碎的条件为150～250W、15～60min。
6.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
7.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
8.根据权利要求1所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，
步骤(5)中得到的藻蓝蛋白的纯化因子大于4.5；
步骤(5)中得到的别藻蓝蛋白的纯化因子大于3.0。
9.权利要求1～8任一项所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
白
其特征在于：
其特征在于：步骤(3)中所述的平衡的次数为3～5次。
其特征在于：步骤(3)中所述的装柱的柱子的规格为1.5cm×20cm的具活塞
层析柱。
的方法的应用，其特征在于：所述的方法用于对各类含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋
的蓝藻、细菌及其市售干粉分离得到藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。
10.根据权利要求9同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法的应
所述的藻蓝蛋白为含硒和/或碲的藻蓝蛋白；
所述的别藻蓝蛋白为含硒和/或碲的别藻蓝蛋白。
用，其特征在于：
说 明 书
技术领域
本发明属于保健品、功能食品和生物医药领域，具体的说涉及一种同时分
背景技术
进入21世纪，世界范围内形成了开发海洋湖沼资源的热潮，海洋药物的开
发有着巨大的发展潜力。其中，广泛、大量存在于藻类藻胆体中的藻胆蛋白，
由于其安全无毒、具有多方面的开发应用价值和较高的生物活性，而
少学者的关注。藻胆蛋白为一类色素复合蛋白，根据其吸收光
蓝蛋白(Phycocyanins，PC)、别藻蓝蛋白
(Phycoerythrin，PE)和藻红蓝蛋白
可作为天然色素广泛应用于
荧光所制成的荧光试
化学及生物工
促进动
离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用。
引起了不
谱性质可分为藻
(Allophycocyanins，APC)、藻红蛋白
(Phycoerythrocyanin，PEC)。藻胆蛋白不仅
食品、化妆品、染料等工业，而且由于其具有强烈
剂、荧光探针、荧光示踪物质等用于临床医学诊断、免疫
程等研究领域中，具有明显抗氧化、抗炎症、提高机体免疫力、
物细胞再生、抑致癌细胞的作用等生物活性(Farooq et al，Chem-Biol
Interact，2004，149，1-7；Subhashini et al，Biochem Pharmacol，2004，68：
Chen and Wong，J Agric Food Chem，2008，56，4352-4358)。
明藻胆蛋白具有良好的应用开发前景。
453-62；
已有的研究结果均表
目前，关于藻胆蛋白的提取工艺研究相对落后，且产物稳定性较低，极大
择
的限制了其工业化生产的发展。对于藻胆蛋白的粗提取，细胞破碎方法的选
是关键步骤。目前国内外基本采用采用反复冻融法、超声波破碎法、
物理破碎、酶溶法、化学渗透法和十二烷基苯磺酸钠裂解法等
胞(Santiago-Santos et al，Process Biochem，2004，39，
匀浆法、
方法来破碎藻细
2047-2052)。其中以反复 冻融-超声破碎联用法使用最为广泛，破碎效果
产品，更适合于规模化开发。但要进一步
必须通过柱层析等其他方法处理。
丙酮沉淀。在纯化技术上，
好，可获得大量的藻胆蛋白粗
分离纯化得到藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
关于蛋白沉淀都普遍使用硫酸胺盐析或冷冻
目前使用的有离子交换色谱和体积排阻色谱法(Chen
and Wong，Phytochemistry，2006，67，2424-2430.)、膨胀床吸附色谱
Chromatogr B，2007，850：267-276.)、疏水性相互作用色谱
谱和体积排阻色谱单独使用或串联使用是常用的
蛋白的纯化方法，但所需的填料昂贵，且
白。近来有研究人员采用双水相萃
and Raghavarao，
有待进
(Niu et al，J
等。其中，离子交换色
也是首选的分离螺旋藻中藻蓝
不能一次性分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋
取方法多次萃取得到纯化的藻蓝蛋白(Pail G
Biochem Eng J，2007，34：156-164)，但该技术目前仍不够成熟，
一步优化。专利号为2.X、名称为“同时制备藻蓝蛋白和别
制
藻蓝蛋白的方法”的国家发明专利提供了一种采用羟基磷灰石柱层析法同时
备藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，但所得产品纯度仅为2.1，无法达
领域的使用要求。因此，如何快速有效的同时分离高纯度藻蓝
白成为人们关注的焦点和努力的方向。
到生物医药
蛋白和别藻蓝蛋
目前有研究表明含硒、碲藻蓝蛋白在抗氧化、抗肿瘤等生物活性方面的表
现优于普通藻蓝蛋白(Chen and Wong，J Agric Food Chem，2008，56：
4358)，因此，如何分离纯化含硒、碲的藻胆蛋白类似物也具有重要
4352-
意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种同时分离高
纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法。
本发明的另一目的在于提供所述同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和
(1)将螺旋藻干粉溶于磷酸盐缓冲溶液中，反复冻融，超声破碎，离心，
(2)使用硫酸铵盐析法初步纯化藻胆蛋白粗提液，具体如下：0℃下加入
饱和度为25～35％的硫酸铵溶液盐析去除杂蛋白，得到的上清液用0℃下饱
为60～70％的硫酸铵溶液盐析，得到的沉淀用磷酸盐缓冲溶液溶解
袋中，于磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，将透析液离心，取上清，
的藻胆蛋白提取液；
上清为藻胆蛋白粗提液；
别藻蓝蛋白的方法，包含以下步骤：
的方法的应用。
和度
并置于透析
得到初步纯化
(3)羟基磷灰石的制备、装柱及平衡：将氯化钙和磷酸氢二钾按摩尔比1∶1
以相同的速度匀速滴入装有相同浓度的氯化钙溶液中；滴加完毕后，静置沉
倾去上清液，沉淀用水冲洗；接着用氢氧化钾溶液调节沉淀的pH＞8，
24小时后，用水冲洗沉淀，弃去
本优化方法制备的羟
买的颗粒太小
淀，
放置12～
细小颗粒，装柱，然后用磷酸盐缓冲溶液平衡；
基磷灰石颗粒大小适中，可达到较好的分离效果，市面上
会严重影响洗脱速度，甚至导致无法洗脱；
(4)将步骤(2)得到的初步纯化的藻胆蛋白提取液上样到步骤(3)制备 的平衡
后的羟基磷灰石柱子，上样量为柱床体积的1/3～1/2；上样完毕后用含
0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度
为0.005～0.01M、0.02～0.03M、0.04～0.06M和0.1～0.12M； 分别
(5)收集含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶
步骤(1)～(3)中所述的磷酸盐缓冲溶液为0.5～10mM、pH 6.5～7.2的
缓冲溶液；
步骤(1)中所述的冻融的次数优选为5～10次，冻融的操作步骤优选为-20～
步骤(1)中所述的超声破碎的频率优选为150～250W，时间优选为15～
步骤(1)中所述的离心的条件优选为10000～13000r/min离心30～60min；
步骤(2)中所述的硫酸铵溶液盐析的百分比均指硫酸铵溶液在0℃时的饱
步骤(2)中所述的透析袋的规格优选为截留量为10KDa；
步骤(2)中所述的离心的条件优选为10000～13000r/min离心30～60min；
步骤(3)中所述的装柱的柱子的规格优选为1.5cm×20cm的具活塞层析
步骤(3)中所述的平衡的次数优选为3～5次；
柱；
离心的目的为除去透析液中的变性蛋白；
和度；
60min；
-10℃冷冻结冰，10～15℃融化完全；
磷酸盐
液(即藻蓝蛋白)和含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.1～0.12M磷酸盐缓
冲溶液(即别藻蓝蛋白)，进行冷冻干燥，保存。
步骤(5)中得到的藻蓝蛋白的纯化因子(A620/A280)大于4.5；
步骤(5)中得到的别藻蓝蛋白的纯化因子(A650/A280)大于
3.0；
所述的同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法可广泛用于各类含
藻
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用反复冻融——超声破碎联用法、硫酸铵分级沉降和羟基磷
灰石柱层析法配合使用，同时获得纯化因子达到4.5的藻蓝蛋白和3的别藻
白及其含硒、碲类似物，并对其纯化规模进行放大，一次层析可获得
纯度蛋白，大大降低纯化成本。按照目前的技术计算，每毫克
民币，远低于SIGMA公司的价格(100美元/毫克)，未
价格仍可大大降低，这为其进一步的工业化生产
泛用于各类含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的蓝
碲的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离
白、别藻蓝蛋白及其含硒、
前景非常广阔，经济
藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的蓝藻、细菌及其市售干粉，分离得到藻蓝蛋白和别
蓝蛋白，还可用于分离含硒、碲的藻蓝蛋白和含硒、碲的别藻蓝蛋白。
蓝蛋
克级的高
成本低于10元人
来随着技术的优化，此
打下基础。同时，此方法可广
藻、细菌及其市售干粉，且对于含硒、
同样适用，是一次性快速分离高纯度藻蓝蛋
碲类似物的通用方法。因此，该研究项目的产业化
社会效益显着。
(2)本发明所述的方法具有成本低廉、工艺简单、条件温和、环境友好，
便于进行大规模工业化生产等优点。
(3)本发明提供制备藻胆蛋白粗提液的通用方法，简便高效，对自配养的
的
附图说明
图1是实施例1中的羟基磷灰石柱层析分离藻胆蛋白的洗脱曲线图。
图2是实施例1得到的藻蓝蛋白(PC)与别藻蓝蛋白(APC)的紫外可见
图3是实施例2中的羟基磷灰石柱层析分离含硒藻胆蛋白的洗脱曲线图。
图4是实施例2中的羟基磷灰石柱层析分离含碲藻胆蛋白的洗脱曲线图。
图5是藻蓝蛋白及其含硒、碲类似物的SDS-PAGE电泳分离图，其中：
泳道M为Marker；泳道1为实施例1制备的藻蓝蛋白；泳道2为实施例2
图6是别藻蓝蛋白及其含硒、碲类似物的SDS-PAGE电泳分离图，其中：
泳道M为Marker；泳道1为实施例1制备的别藻蓝蛋白；泳道2为实施例
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式
2制备的含硒的别藻蓝蛋白；泳道3为实施例2制备的含碲的别藻蓝蛋白。
制备的含硒的藻蓝蛋白；泳道3为实施例2制备的含碲的藻蓝蛋白。
光谱图。
各种蓝藻、鲜活细菌，及其市售干粉均适用，降低对原料的要求，便于方法
推广。
不限于此。
实施例1藻蓝蛋白及别藻蓝蛋白的分离纯化
(1)羟基磷灰石的制备：
将0.4M氯化钙和0.4M磷酸氢二钾500mL均分别以5ml/min的速度滴加
置
到装有200ml浓度为0.4M的氯化钙溶液的烧杯中，不断搅拌。完毕后，静
沉淀，倾去上清液，用足够的自来水冲洗。一边向沉淀中加入2M的
一边搅拌，确保沉淀pH＞8，放置12h后，用大量自来水冲洗，
装入规格为1.5cm×20cm的具活塞层析柱中。然后用
液(pH＝6.8)平衡3-5次即可，其中羟基磷灰石沉
(pH＝6.8)体积比约为1∶1。
氢氧化钾，
弃去细小颗粒，
0.001M磷酸盐缓冲溶
淀和1mM磷酸盐缓冲溶液
(2)羟基磷灰石柱层析法分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白
①藻胆蛋白粗提液的制备：取商业来源的螺旋藻粉或自培养螺旋藻。自培
养螺旋藻的培养方法如下：在三角烧瓶中加入Zarrouk培养液，接种螺旋藻
节藻的初始A560＝0.20(于光照培养箱中培养，温度
照强度为72μmol·m-2·s-
pH＝6.8的磷
冻融(-
并调
(30±2)℃，pH 8～9，光
1；培养至11d采收，用400目的纱绢过滤)于1mM、
酸盐缓冲液溶液中，控制其比值为1g藻：10ml溶液，混匀后反复
20℃冷冻结冰后置于10℃的水中完全解冻)5次，超声破碎15～60min，
②硫酸铵分级沉降：0℃下，向藻胆蛋白粗提液中加入硫酸铵固体配成饱和
度为30％的硫酸铵溶液，盐析60min后10000r/min，30min高速离心，保留
功率200W。10000r/min，高速离心60min，上清液为藻胆蛋白粗提液。
上 清液，弃去沉淀。上清液用饱和度为65％硫酸铵溶液盐析、离心后，
液，向沉淀中加入少量1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲液溶解
KDa的透析袋中，于1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶
r/min，60min高速离心除去变性蛋白，得到初步
弃去上清
并置于接流量为10
液中透析过夜后，10000
纯化后的藻胆蛋白溶液。
③装柱及平衡：将羟基磷灰石混合液摇匀，玻棒引流于层析柱中，敲击层
为
析柱以确保填装均匀紧实。将上述初步纯化后的藻胆蛋白溶液上柱，上样量
柱床体积的1/3，待其被羟基磷灰石完全吸附后，开始洗脱，选用含
钠的不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)作为洗脱液，控制
分别为0.005、0.020、0.050、0.100M，流速为
藻蓝蛋白、混与别藻蓝蛋白中的藻蓝蛋白
离藻胆蛋白的洗脱曲线如图1所示，
组分3为藻蓝蛋白与别藻蓝
0.2M氯化
梯度洗脱的浓度
0.8ml/min，依次洗脱出杂蛋白、
和别藻蓝蛋白。羟基磷灰石柱层析分
其中组分1为杂蛋白，组分2为藻蓝蛋白，
蛋白混合物，组分4为别藻蓝蛋白。
④收集及保存：分别收集藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，并冷冻干燥得干粉保存
⑤光谱表征：分别对藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白进行光谱扫描(如图2所示)，
测定其纯度分别为A620/A280＞4.5，
于-20℃。
A650/A280＞3.0。
实施例2含硒藻蓝蛋白及含硒别藻蓝蛋白的分离纯化
羟基磷灰石的制备步骤与上同。通过如下步骤分离制备含硒藻蓝蛋白和含
硒别藻蓝蛋白：
(1)藻胆蛋白粗提液的制备：取商业来源或者自培养的富硒培养螺旋藻。
自培养富硒螺旋藻培养方法如下：在三角烧瓶中加入Zarrouk培养液，接种
藻并调节藻的初始A560＝0.20(于光照培养箱中培养，温
9，光照强度为72μmol·m-2·s-1；
次为100、150、
螺旋
度(30±1)℃，pH 8～
分别在7～9d添加亚硒酸钠，以硒浓度计量依
200mg·L-1，从第7天开始每隔24小时添加累计加硒量为450
mg·L-1；培养至11d采收，用400目的纱绢过滤)于1mM、pH
冲液溶液中，控制其比值为1g藻：10ml溶液，混匀后
冰后置于10℃完全解冻)5次，超声破碎10min，
60min高速离心，上清液为含硒藻胆蛋白粗提液。
＝6.8的磷酸盐缓
反复冻融(-20℃冷冻结
功率200W。10000r/min，
(2)硫酸铵分级沉降：0℃下，向藻胆蛋白粗提液中加入硫酸铵固体配成
留
饱和度为30％硫酸铵溶液，盐析60min后10000r/min，30min高速离心，保
上清液，弃去沉淀。上清液用饱和度为65％硫酸铵溶液盐析、离心
清液，向沉淀中加入少量1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲液溶
10KDa的透析袋中，于1mM、pH＝6.8的磷酸盐缓冲
r/min，60min高速离心除去变性蛋白，得到初步
后，弃去上
解并置于接流量为
溶液中透析过夜后，10000
纯化后的藻胆蛋白溶液。
(3)装柱及平衡：将羟基磷灰石混合液摇匀，玻棒引流于层析柱中，敲击
上
层析柱以确保填装均匀紧实。将上述初步纯化后的含硒藻胆蛋白溶液上柱，
样量为柱床体积的1/3，待其被羟基磷灰石完全吸附后，开始洗脱，
氯化钠的不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)作为洗脱液，
浓度分别为0.005、0.020、0.050、0.100M，流速为
白(如图3组分1所示)、含硒藻蓝蛋白(如
与别藻蓝蛋白混合物(如图3组分3所示)、
示)。
选用含0.2M
控制梯度洗脱的
0.8ml/min，依次洗脱出杂蛋
图3组分2所示)、含硒藻蓝蛋白
含硒别藻蓝蛋白(如图3组分4所
(4)收集及保存：分别收集含硒藻蓝蛋白和含硒别藻蓝蛋白，并冷冻干燥
(5)光谱表征及硒含量测定：分别对含硒藻蓝蛋白和含硒别藻蓝蛋白进行
光谱扫描，测定其纯度分别为A620/A280＞4.5，
离子体原子发
得干粉保存于-20℃。
A650/A280＞3.0。通过电感耦合等
射光谱(ICP-AES)法测得两种藻胆蛋白的硒含量分别为496.5和
实施例3含碲的藻蓝蛋白及别藻蓝蛋白的分离纯化
羟基磷灰石的制备步骤与上同。通过如下步骤分离制备含碲藻蓝蛋白和别
(1)藻胆蛋白粗提液的制备：取商业来源的螺旋藻粉或自培养螺旋藻。富
碲螺旋藻的培养方法如下：在三角烧瓶中加入Zarrouk培养液，接种
并调节藻的初始A560＝0.20(于光照培养箱中培养，
9，光照强度为72μmol·m-2·s-
次为200、
藻蓝蛋白：
589.5μg/g protein。
sis
温度(30±2)℃，pH＝8～
1；分别在7～9d添加亚碲酸钠，以碲浓度计量依
250、250mg·L-1，从第7天开始每隔24小时添加，累计加碲量为700
mg·L-1；培养至11d采收，用400目的纱绢过滤。)于1mM pH
冲液溶液中，控制其比值为1g藻：10ml溶液，混匀后
冰后置于10℃完全解冻)5次，超声破碎15～
60min高速离心，上清液为含碲藻胆蛋白
＝6.8的磷酸盐缓
反复冻融(-20℃冷冻结
60min，功率200W。10000r/min，
粗提液。
(2)硫酸铵分级沉降：0℃下，向藻胆蛋白粗提液中加入硫酸铵固体配成
留
饱和度为30％硫酸铵溶液，盐析60min后10000r/min，30min高速离心，保
上清液，弃去沉淀。上清液用饱和度为65％硫酸铵溶液盐析、离心
清液，向沉淀中加入少量1mM pH＝6.8的磷酸盐缓冲液溶解
KDa的透析袋中，于1mM pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液
60min高速离心除去变性蛋白，得到初步
后，弃去上
并置于接流量为10
中透析过夜后，10000r/min，
纯化后的藻胆蛋白溶液。
(3)装柱及平衡：将羟基磷灰石混合液摇匀，玻棒引流于层析柱中，敲击
上
层析柱以确保填装均匀紧实。将上述初步纯化后的含碲藻胆蛋白溶液上柱，
样量为柱床体积的1/3，待其被羟基磷灰石完全吸附后，开始洗脱，
氯化钠的不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.8)作为洗脱液，
浓度分别为0.005、0.020、0.050、0.100M，流速为
蛋白(如图4组分1所示)、含碲藻蓝蛋白(如图4
白与别藻蓝蛋白混合
所示)。
选用含0.2M
控制梯度洗脱的
0.8ml/min，依次洗脱出杂
组分2所示)、含碲藻蓝蛋
物(如图4组分3所示)、含碲别藻蓝蛋白(如图4组分4
(4)收集及保存：分别收集含碲藻蓝蛋白和含碲别藻蓝蛋白，并冷冻干燥
(5)光谱表征及碲含量测定：分别对含碲藻蓝蛋白和含碲别藻蓝蛋白进行
光谱扫描，测定其纯度分别为A620/A280＞4.5，
离子体原子发
得干粉保存于-20℃。
A650/A280＞3.0。通过电感耦合等
射光谱(ICP-AES)法测得两种藻胆蛋白的碲含量分别为611.1和
实施例4聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳及MALDI-TOF/MS鉴定
分离纯化的蛋白的纯度用SDS-PAGE进行确认，并同时对相应的亚基进行
625.3μg/g protein。
分离。实验采用Laemmli法的垂直不连续电泳系统，分离胶聚丙烯酰胺质
数为15％。加样量为40μg蛋白每孔，样品与等体积的SDS-样品缓
分质量分数为：2％的SDS，10％甘油，5％巯基乙醇、0.002％
pH6.8的Tris-HCl)混合，并在95℃煮5min，在室温下
马斯亮蓝染液进行染色。结果如图5和图6所示。
量分
冲液(各成
溴酚蓝和60mM
进行电泳，完成后用考
将分离出的蛋白条带从胶中挑出，切成碎片后进行胶内胰酶酶解过夜(参
考文献进行：Chen Tianfeng，Wong Yum-Shing，Zheng，
characterization of selenium-W.(2006)Purification and
为
containing phycocyanin from selenium-enriched
Spirulina hemistry.67，2424-2430)。酶解后的多肽用体积分数
5％的三氟乙酸-乙腈溶液超声辅助提取10分钟，提取液在SpeedVac
所得多肽样品用体积分数为0.1％的三氟乙酸-乙腈溶液
柱(Millipore)进行除盐富集，再用含0.1％三氟乙
液点样并进行基质辅助激光解吸-串联飞
使用仪器为
是一种
仪器上蒸干。
溶解，并用Zip Tip u-C18
酸的50％乙腈溶液洗脱，所得溶
行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)分析，
ABI Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer。MALDI-TOF-TOF
新兴、有效的蛋白质的鉴定技术，是目前蛋白质组研究中较为常用、准
确的分析方法。该技术可以提供肽质量指纹谱(Peptide mass fingerprinting，
及肽谱序列信息。通过比较蛋白酶解后得到的肽片断质量图谱对蛋白
定，以Protein Score＞60作为数据可信的鉴定标准。对本发明
藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白及其含硒、碲类似物的检测结果
PC、Se-PC、Te-PC和APC、Se-APC、Te-APC
No.和分子量，发现均无差异。这
PMF)
质进行鉴
实施例制备得到的
如表1所示，分别对比
三组蛋白的α、β亚基的Accession
是由于NCBI等蛋白数据库均不存在任何关于
含硒、碲蛋白的序列，因此含硒、碲蛋白被识别成了普通蛋白而具有相同的
Accession No.和分子量。但含硒、碲组和普通组的
identified peptide No.和Protein Score均存在差异，说明含硒、碲组和普
ICP-AES的结果可以证明硒、碲以通组蛋白在结构上存在差异，结合
成功结合到蛋白中。
表1、MALDI-TOF/MS鉴定藻蓝蛋白(PC)与别藻蓝蛋白(APC)及其含硒、碲类似物
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施
替
例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、
代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范
围之内。