2024年5月23日发(作者：禚暮)
TBC1D4在胰腺癌中表达上调及其诱导的体液免疫应答
姜小华;单阁;孙建文;刘春芳;特尼格尔;代龙;汪伟;吕元
【摘 要】目的 先前利用胰腺癌患者血清筛选睾丸cDNA文库,获得胰腺癌相关抗
原:TBC1D4.本研究分析TBC1D4在胰腺癌患者中的表达上调及其诱导的自身体液
免疫应答.方法 原核表达TBC1D4蛋白,金属镍鳌合亲和层析柱进行蛋白纯
化,Western blot检测22例胰腺癌患者的癌组织和对应癌旁组织TBC1D4表达情
况;ELISA方法测定95胰腺癌患者与150例健康对照者血清中抗TBC1D4蛋白特
异性抗体的水平.结果 表达纯化重组蛋白TBC1D4,并诱导出多克隆抗体;胰腺癌癌
组织TBC1D4蛋白表达水平显著上调(P<0.01);95例患者血清中,19例
(20%,19/95)血清抗TBC1D4抗体阳性,150例健康对照者血清全部为阴性.患者抗
体阳性率显著高于健康对照者(P<0.01).结论 TBC1D4蛋白分子在胰腺癌组织中表
达上调,并具有免疫原性,可能是胰腺癌实验诊断与免疫治疗的一个良好的靶抗原.
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2010(014)007
【总页数】4页(P1038-1041)
【关键词】胰腺癌;肿瘤抗原;蛋白表达与纯化;免疫反应性
【作 者】姜小华;单阁;孙建文;刘春芳;特尼格尔;代龙;汪伟;吕元
【作者单位】解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;贵阳医学院,贵州,贵阳
550004;解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;复旦大学华山医院检验医学
中心,上海200040;解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;解放军第八五医院,
检验病理科,上海200052;解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;复旦大学华
山医院检验医学中心,上海200040
【正文语种】中 文
【中图分类】R736.7
在先前的研究中,我们通过重组cDNA表达文库血清学分析技术(serological
analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX),筛选出14种胰腺
癌相关抗原,其中TBC1D4分子是首次筛选发现的新肿瘤抗原[1]。TBC1D4含
TBC(Tre-2/Bub2/Cdc16)结构域,该结构域与癌基因Tre-2同源,被认为具有调控细
胞周期与细胞分化的功能[2],一些含TBC结构域的分子被证实与肿瘤相关,如
NB4S[3]等。Zhou等应用SEREX技术发现了含TBC结构域的新肿瘤抗原,命名为
PARIS-1[4]。2007年Nakashima等发现TBC7与肿瘤相关[5]。
目前尚无文献报道我们筛选发现的TBC1D4与肿瘤相关。我们分析TBC1D4蛋白
在胰腺癌中的表达水平及其在胰腺癌患者中诱导抗体应答的频率,以期了解其作为
胰腺癌实验诊断与免疫治疗靶抗原的可能性。
1.1 标本来源 患者组95例,为病理诊断胰腺导管腺癌的初诊患者,包括复旦大学胰
腺病研究所住院患者73例,以及八五医院住院手术患者22例,其中男 55例,女40
例,年龄 30-75岁,平均(52±16)岁。选取健康体检者150例作为对照组,男女各75
例,年龄31-70岁,平均(52±14)岁。抽取静脉血,以EDTA抗凝,分离血清储存于-80℃
备用。胰腺癌组织与癌旁组织即刻放入冻存管,置于液氮中保存。
1.2 试剂 DH-5α、BL-21(DE3)由本室保存;SD大鼠(Sprague Dawley,远交
群大鼠)由第二军医大学动物中心提供;载体pET-28a(+)购自Novagen公司;Ni-
NTA-agarose柱为Vector公司产品;限制性内切酶、T4 DNA连接酶、RT-PCR
试剂盒、总RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)
购自TaKaRa公司。硝酸纤维素膜、HRP标记兔抗人抗体、显色底物TMB购自
Pharmarcia公司。Western ECL试剂盒购自Cell Signaling公司。
1.3 原核表达质粒的构建 根据载体多克隆酶切位点及TBC1D4的序列,设计引物。
引物由上海生工生物科技有限公司合成,引物的序列为:P1
5′CGCGGATCCATGGAGCCGCCCAGCTGCAT;P2
5′GCCCTCGAGTGGCTTATTTCCTATCTTGG。从健康体检者外周血单个核细胞
(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中提取总RNA,将mRNA反转录合
成cDNA,PCR反应条件为:94℃预变性5 min后,94℃变性30 s;50℃退火30 s;72℃
延伸4.5min,30个循环结束后72℃延伸15 min。扩增获得的目的片段与pET-
28a(+)经双酶切后,分别纯化回收后加T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜,转化到
DH5α中,涂布到卡那霉素抗性的LB培养板上,37℃培养12-16 h,挑选单克
隆进行测序,鉴定目的片段的序列及编码阅读框是否正确。
1.4 TBC1D4蛋白表达与纯化 将测序鉴定正确的pET-28a(+)-TBC1D4原核表达
质粒转入 BL-21(DE3),挑取单克隆接种到含卡那霉素的LB培养基
中,37℃250 r/min培养过夜,按1∶100的比例接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养
基中,37℃培养至OD600≈0.6时,加IPTG至终浓度为1 mmol/L,37℃诱导3 h。
离心收集菌体,每克菌体加3 ml裂解液重悬,超声波破碎菌体,10 000×g离心10
min,收集上清,按照Ni-NTA-agarose柱操作说明书纯化重组蛋白,经SDS-PAGE
鉴定后用pH7.4的PBS透析过夜。
1.5 抗血清的制备 纯化后的蛋白与弗式佐剂等体积混合乳化,腹部皮下多点注射免
疫SD大鼠。首次免疫用完全佐剂,每只大鼠200 mg纯化蛋白。之后的免疫用不
完全佐剂,每只大鼠每次100 mg纯化蛋白。隔周免疫1次,共免疫3次。第3次免
疫2周后心脏采血,离心得血清。用ELISA和Westernblot检测抗血清的效价和特
异性。
1.6 Western-blot检测 将组织在冰上裂解、匀浆,15 000×g离心30 min,取上清,
以考马斯亮蓝G250结合法测定样品蛋白含量。等量蛋白样品经10%的SDS-
PAGE分离后,电转移至硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉封闭4℃过夜,加制备的抗血清
(1∶10 000稀释)为一抗,抗β-actin抗体为1∶5 000,室温摇晃2 h,加辣根过氧化
物酶标记的二抗室温摇晃1 h,暗室内增强的化学发光反应(ECL反应)显色,X线底片
曝光、显影、定影,显色条带通过数字成像系统进行光密度扫描分析。
1.7 ELISA测定 向中亲和力ELISA板中加入5 μ g/μ l纯化蛋白,每孔为 100 μ l,4℃
包被过夜 。5%BSA封闭后,加入1∶200稀释的待测血清,37℃孵育1 h,加入HRP
标记的兔抗人二抗,37℃孵育1 h,洗涤后加底物显色液TMB显色,H2SO4终止反应,
在495 nm下读取OD值。空白对照孔用PBS代替融合蛋白包被ELISA板。临界
值计算:Cutoff value=0.10+空白对照OD值。
1.8 统计处理 应用SPSS11.0软件进行统计学分析。患者组与对照组抗体阳性率差
异的假设检验和外周血TBC1D4抗体、癌组织TBC1D4蛋白的相关性比较采用卡
方检验,癌与其相应癌旁组织中的TBC1D4蛋白表达水平比较采用配对t检验,以P
＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 TBC1B4蛋白重组表达质粒的构建 从PBMC中抽提总RNA,以逆转录出的
cDNA为模板,PCR扩增TBC1B4蛋白基因编码区(3896 bp)。克隆到表达载体
pET-28a(+),经测序鉴定,证实原核表达载体构建成功,序列与GenBank中序列一致。
2.2 蛋白的原核表达和纯化结果 测序正确的重组克隆经IPTG诱导表达和His亲和
纯化,得到纯度较高的相对分子质量约为160 KD的TBC1B4蛋白(图1)。
2.3 抗血清的制备与鉴定 经鉴定,免疫大鼠所得的多克隆抗体能够应用于ELISA与
Western blot实验。ELISA测定抗体的效价为1∶25 600。
2.4 Western-blot法 蛋白阳性条带在相对分子质量约为160 KD处,以
TBC1D4/β-actin作为 TBC1D4蛋白的相对表达量,癌旁组织中的相对平均表达量
仅为0.041,而癌组织为0.136。TBC1D4在肿瘤组织中的表达水平显著高于相应癌
旁组织(P＜0.01),见图2。
2.5 外周血抗TBC1D4抗体水平 95例胰腺癌患者中发现有19例(20%)的患者血
清抗TBC1D4抗体阳性,而150例健康对照者全部为阴性。两组相比有统计学意义
(P＜0.01)。抗TBC1D4抗体用于诊断胰腺癌患者的特异性、敏感性、阳性预测值
和阴性预测值分别为100%、20%、100%和66.4%。
2.7 癌组织TBC1D4蛋白与外周血TBC1D4抗体之间的相关性 有22例患者既分
析了其外周血抗TBC1D4抗体水平,又用Western-blot法检测癌组织TBC1D4蛋
白表达.以肿瘤中相对平均表达量高于相应癌旁组织2倍者,判断为TBC1D4蛋白上
调,共有7例上调。卡方检验显示,TBC1D4蛋白上调与抗体阳性之间有显著相关性
(P＜0.01)。结果如表1。
胰腺癌的发病率近年来有明显增高趋势,按人口统计其发病率约为每年10/10万人,
在所有较常见的肿瘤中5年生存率最低[6]。胰腺癌早期诊断困难,手术切除率低,化
疗和放疗对胰腺癌的疗效不确切,同时也有较多的副作用。因此不能切除的晚期胰
腺癌尚无有效的治疗方法[7]。随着生物技术的飞速发展,有关胰腺癌免疫治疗、基
因治疗的相关报道日趋增多,逐渐形成了第四种治疗模式,可望在胰腺癌的治疗方面
开辟新的途径。要研制肿瘤疫苗,寻找胰腺癌特异性肿瘤抗原至关重要。
SEREX是一种强有力的肿瘤抗原筛选技术,在肿瘤的诊断、防治及肿瘤分子机制的
研究中有着广泛的应用前景[8]。我们先前经6轮筛选睾丸cDNA文库后,共得到
14个独立阳性克隆基因,其中其中TBC1D4分子是首次筛选发现的新肿瘤抗原。在
本研究中我们克隆表达、纯化TBC1D4蛋白,并免疫动物,获得了进一步研究所需的
TBC1D4蛋白与相应的特异性抗体。
肿瘤抗原的表达是免疫治疗的前提。因此为了在蛋白水平上鉴定胰腺癌患者肿瘤组
织中TBC1D4分子表达上调,我们用Western blot法检测胰腺癌患者的癌组织和
对应癌旁正常组织TBC1D4表达情况。Western blot法结果表明,癌组织
TBC1D4表达水平显著上调。
应用于免疫治疗靶分子的肿瘤抗原还应有良好的免疫原性,能诱导机体产生特异性
免疫应答。为进一步评价蛋白的免疫原性,我们利用制备的TBC1D4纯化蛋白建
ELISA法,检测了胰腺癌患者对TBC1D4的自发体液免疫应答及其频率。95例胰腺
癌患者中有20%的患者血清抗TBC1D4抗体阳性,而150例健康对照者全部为阴
性。虽然抗TBC1D4抗体阳性率不高,但假阳性率低,并且根据相关文献来看,肿瘤
抗原刺激机体体液免疫应答产生的相应抗体的阳性率普遍都不高,约为10%-
30%[4]。在Western-blot分析22例患者组织中,仅在TBC1D4蛋白上调的7例
患者中有6例抗TBC1D4抗体阳性。卡方检验显示,TBC1D4蛋白上调与抗体阳性
之间有相关性(P＜0.01)。结果提示TBC1D4蛋白上调可以在胰腺癌患者体内诱导
自发性体液免疫应答。
从总体情况来看,在蛋白水平上,TBC1B4在胰腺肿瘤细胞中表达上调,同时,过高表达
的TBC1D4蛋白又可以在胰腺癌患者体内诱导抗原特异性体液免疫应答。虽然
TBC1D4能否诱导肿瘤特异的细胞反应,还需要进一步的体外实验来验证,但体液免
疫和细胞免疫存在密切的联系,抗体的产生需要细胞和CD4+细胞的共同作用[9]。
我们的研究提示TBC1D4蛋白可能是胰腺癌免疫治疗的一个有价值的候选抗原。
【相关文献】
[1]姜小华,狄 杨,蒋晓飞,等.从睾丸cDNA表达文库筛选胰腺癌肿瘤抗原[J].中华检验医学杂
志,2007,30(7):750.
[2]Koumanov F,Holman y Tbc1d1 and Tbc1d4 proteins link signalling and
membrane trafficking pathways[J].Biochem J,2007,403(2):e9.
[3]Roberts T,Chernova O,Cowell 4S,a member of the TBC1 domain family of genes,is
truncated as a result of a constitutional t(1;10)(p22;q21)chromosome translocation in a
patient with stage 4S neuroblastoma[J].HumMol Genet,1998,7(7):1169.
[4]Zhou Y,Toth M,Hamman MS,et gical Cloning of PARIS-1:A New TBC Domain-
Containing,Immunogenic Tumor Antigen from a Prostate Cancer Cell Line[J].Biochem
Biophys Res Communs,2002,290(2):830.
[5]Nakashima A,Yoshino K,Miyamoto T,et fication of TBC7having TBC domain as a
novel binding protein to TSC1-TSC2 complex[J].Biochem Biophys Res
Communs,2007,361(1):218.
[6]Cardenes HR,Chiorean EG,Dewitt J,et y advanced pancreatic cancer:current
therapeutic approach[J].Oncologist,2006,11(6):612.
[7]张维建,韩少良,蒋飞照,等.胰腺癌根治切除术后远期疗效的多因素分析[J].中华肿瘤杂
志,2008,30(11):870.
[8]Sahin U,Tureci O,Pfreundschuh gical identification of human tumor
antigens[J].Curr Opin Immunol,1997,9(5):7096.
[9]Andersen MH,Sorensen RB,Schrama D,et treatment:the combination of
vaccination with other therapies[J].Cancer Immunol Immunother,2008,57(11):1735.
2024年5月23日发(作者：禚暮)
TBC1D4在胰腺癌中表达上调及其诱导的体液免疫应答
姜小华;单阁;孙建文;刘春芳;特尼格尔;代龙;汪伟;吕元
【摘 要】目的 先前利用胰腺癌患者血清筛选睾丸cDNA文库,获得胰腺癌相关抗
原:TBC1D4.本研究分析TBC1D4在胰腺癌患者中的表达上调及其诱导的自身体液
免疫应答.方法 原核表达TBC1D4蛋白,金属镍鳌合亲和层析柱进行蛋白纯
化,Western blot检测22例胰腺癌患者的癌组织和对应癌旁组织TBC1D4表达情
况;ELISA方法测定95胰腺癌患者与150例健康对照者血清中抗TBC1D4蛋白特
异性抗体的水平.结果 表达纯化重组蛋白TBC1D4,并诱导出多克隆抗体;胰腺癌癌
组织TBC1D4蛋白表达水平显著上调(P<0.01);95例患者血清中,19例
(20%,19/95)血清抗TBC1D4抗体阳性,150例健康对照者血清全部为阴性.患者抗
体阳性率显著高于健康对照者(P<0.01).结论 TBC1D4蛋白分子在胰腺癌组织中表
达上调,并具有免疫原性,可能是胰腺癌实验诊断与免疫治疗的一个良好的靶抗原.
【期刊名称】《中国实验诊断学》
【年(卷),期】2010(014)007
【总页数】4页(P1038-1041)
【关键词】胰腺癌;肿瘤抗原;蛋白表达与纯化;免疫反应性
【作 者】姜小华;单阁;孙建文;刘春芳;特尼格尔;代龙;汪伟;吕元
【作者单位】解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;贵阳医学院,贵州,贵阳
550004;解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;复旦大学华山医院检验医学
中心,上海200040;解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;解放军第八五医院,
检验病理科,上海200052;解放军第八五医院,检验病理科,上海200052;复旦大学华
山医院检验医学中心,上海200040
【正文语种】中 文
【中图分类】R736.7
在先前的研究中,我们通过重组cDNA表达文库血清学分析技术(serological
analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX),筛选出14种胰腺
癌相关抗原,其中TBC1D4分子是首次筛选发现的新肿瘤抗原[1]。TBC1D4含
TBC(Tre-2/Bub2/Cdc16)结构域,该结构域与癌基因Tre-2同源,被认为具有调控细
胞周期与细胞分化的功能[2],一些含TBC结构域的分子被证实与肿瘤相关,如
NB4S[3]等。Zhou等应用SEREX技术发现了含TBC结构域的新肿瘤抗原,命名为
PARIS-1[4]。2007年Nakashima等发现TBC7与肿瘤相关[5]。
目前尚无文献报道我们筛选发现的TBC1D4与肿瘤相关。我们分析TBC1D4蛋白
在胰腺癌中的表达水平及其在胰腺癌患者中诱导抗体应答的频率,以期了解其作为
胰腺癌实验诊断与免疫治疗靶抗原的可能性。
1.1 标本来源 患者组95例,为病理诊断胰腺导管腺癌的初诊患者,包括复旦大学胰
腺病研究所住院患者73例,以及八五医院住院手术患者22例,其中男 55例,女40
例,年龄 30-75岁,平均(52±16)岁。选取健康体检者150例作为对照组,男女各75
例,年龄31-70岁,平均(52±14)岁。抽取静脉血,以EDTA抗凝,分离血清储存于-80℃
备用。胰腺癌组织与癌旁组织即刻放入冻存管,置于液氮中保存。
1.2 试剂 DH-5α、BL-21(DE3)由本室保存;SD大鼠(Sprague Dawley,远交
群大鼠)由第二军医大学动物中心提供;载体pET-28a(+)购自Novagen公司;Ni-
NTA-agarose柱为Vector公司产品;限制性内切酶、T4 DNA连接酶、RT-PCR
试剂盒、总RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)
购自TaKaRa公司。硝酸纤维素膜、HRP标记兔抗人抗体、显色底物TMB购自
Pharmarcia公司。Western ECL试剂盒购自Cell Signaling公司。
1.3 原核表达质粒的构建 根据载体多克隆酶切位点及TBC1D4的序列,设计引物。
引物由上海生工生物科技有限公司合成,引物的序列为:P1
5′CGCGGATCCATGGAGCCGCCCAGCTGCAT;P2
5′GCCCTCGAGTGGCTTATTTCCTATCTTGG。从健康体检者外周血单个核细胞
(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中提取总RNA,将mRNA反转录合
成cDNA,PCR反应条件为:94℃预变性5 min后,94℃变性30 s;50℃退火30 s;72℃
延伸4.5min,30个循环结束后72℃延伸15 min。扩增获得的目的片段与pET-
28a(+)经双酶切后,分别纯化回收后加T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜,转化到
DH5α中,涂布到卡那霉素抗性的LB培养板上,37℃培养12-16 h,挑选单克
隆进行测序,鉴定目的片段的序列及编码阅读框是否正确。
1.4 TBC1D4蛋白表达与纯化 将测序鉴定正确的pET-28a(+)-TBC1D4原核表达
质粒转入 BL-21(DE3),挑取单克隆接种到含卡那霉素的LB培养基
中,37℃250 r/min培养过夜,按1∶100的比例接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养
基中,37℃培养至OD600≈0.6时,加IPTG至终浓度为1 mmol/L,37℃诱导3 h。
离心收集菌体,每克菌体加3 ml裂解液重悬,超声波破碎菌体,10 000×g离心10
min,收集上清,按照Ni-NTA-agarose柱操作说明书纯化重组蛋白,经SDS-PAGE
鉴定后用pH7.4的PBS透析过夜。
1.5 抗血清的制备 纯化后的蛋白与弗式佐剂等体积混合乳化,腹部皮下多点注射免
疫SD大鼠。首次免疫用完全佐剂,每只大鼠200 mg纯化蛋白。之后的免疫用不
完全佐剂,每只大鼠每次100 mg纯化蛋白。隔周免疫1次,共免疫3次。第3次免
疫2周后心脏采血,离心得血清。用ELISA和Westernblot检测抗血清的效价和特
异性。
1.6 Western-blot检测 将组织在冰上裂解、匀浆,15 000×g离心30 min,取上清,
以考马斯亮蓝G250结合法测定样品蛋白含量。等量蛋白样品经10%的SDS-
PAGE分离后,电转移至硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉封闭4℃过夜,加制备的抗血清
(1∶10 000稀释)为一抗,抗β-actin抗体为1∶5 000,室温摇晃2 h,加辣根过氧化
物酶标记的二抗室温摇晃1 h,暗室内增强的化学发光反应(ECL反应)显色,X线底片
曝光、显影、定影,显色条带通过数字成像系统进行光密度扫描分析。
1.7 ELISA测定 向中亲和力ELISA板中加入5 μ g/μ l纯化蛋白,每孔为 100 μ l,4℃
包被过夜 。5%BSA封闭后,加入1∶200稀释的待测血清,37℃孵育1 h,加入HRP
标记的兔抗人二抗,37℃孵育1 h,洗涤后加底物显色液TMB显色,H2SO4终止反应,
在495 nm下读取OD值。空白对照孔用PBS代替融合蛋白包被ELISA板。临界
值计算:Cutoff value=0.10+空白对照OD值。
1.8 统计处理 应用SPSS11.0软件进行统计学分析。患者组与对照组抗体阳性率差
异的假设检验和外周血TBC1D4抗体、癌组织TBC1D4蛋白的相关性比较采用卡
方检验,癌与其相应癌旁组织中的TBC1D4蛋白表达水平比较采用配对t检验,以P
＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 TBC1B4蛋白重组表达质粒的构建 从PBMC中抽提总RNA,以逆转录出的
cDNA为模板,PCR扩增TBC1B4蛋白基因编码区(3896 bp)。克隆到表达载体
pET-28a(+),经测序鉴定,证实原核表达载体构建成功,序列与GenBank中序列一致。
2.2 蛋白的原核表达和纯化结果 测序正确的重组克隆经IPTG诱导表达和His亲和
纯化,得到纯度较高的相对分子质量约为160 KD的TBC1B4蛋白(图1)。
2.3 抗血清的制备与鉴定 经鉴定,免疫大鼠所得的多克隆抗体能够应用于ELISA与
Western blot实验。ELISA测定抗体的效价为1∶25 600。
2.4 Western-blot法 蛋白阳性条带在相对分子质量约为160 KD处,以
TBC1D4/β-actin作为 TBC1D4蛋白的相对表达量,癌旁组织中的相对平均表达量
仅为0.041,而癌组织为0.136。TBC1D4在肿瘤组织中的表达水平显著高于相应癌
旁组织(P＜0.01),见图2。
2.5 外周血抗TBC1D4抗体水平 95例胰腺癌患者中发现有19例(20%)的患者血
清抗TBC1D4抗体阳性,而150例健康对照者全部为阴性。两组相比有统计学意义
(P＜0.01)。抗TBC1D4抗体用于诊断胰腺癌患者的特异性、敏感性、阳性预测值
和阴性预测值分别为100%、20%、100%和66.4%。
2.7 癌组织TBC1D4蛋白与外周血TBC1D4抗体之间的相关性 有22例患者既分
析了其外周血抗TBC1D4抗体水平,又用Western-blot法检测癌组织TBC1D4蛋
白表达.以肿瘤中相对平均表达量高于相应癌旁组织2倍者,判断为TBC1D4蛋白上
调,共有7例上调。卡方检验显示,TBC1D4蛋白上调与抗体阳性之间有显著相关性
(P＜0.01)。结果如表1。
胰腺癌的发病率近年来有明显增高趋势,按人口统计其发病率约为每年10/10万人,
在所有较常见的肿瘤中5年生存率最低[6]。胰腺癌早期诊断困难,手术切除率低,化
疗和放疗对胰腺癌的疗效不确切,同时也有较多的副作用。因此不能切除的晚期胰
腺癌尚无有效的治疗方法[7]。随着生物技术的飞速发展,有关胰腺癌免疫治疗、基
因治疗的相关报道日趋增多,逐渐形成了第四种治疗模式,可望在胰腺癌的治疗方面
开辟新的途径。要研制肿瘤疫苗,寻找胰腺癌特异性肿瘤抗原至关重要。
SEREX是一种强有力的肿瘤抗原筛选技术,在肿瘤的诊断、防治及肿瘤分子机制的
研究中有着广泛的应用前景[8]。我们先前经6轮筛选睾丸cDNA文库后,共得到
14个独立阳性克隆基因,其中其中TBC1D4分子是首次筛选发现的新肿瘤抗原。在
本研究中我们克隆表达、纯化TBC1D4蛋白,并免疫动物,获得了进一步研究所需的
TBC1D4蛋白与相应的特异性抗体。
肿瘤抗原的表达是免疫治疗的前提。因此为了在蛋白水平上鉴定胰腺癌患者肿瘤组
织中TBC1D4分子表达上调,我们用Western blot法检测胰腺癌患者的癌组织和
对应癌旁正常组织TBC1D4表达情况。Western blot法结果表明,癌组织
TBC1D4表达水平显著上调。
应用于免疫治疗靶分子的肿瘤抗原还应有良好的免疫原性,能诱导机体产生特异性
免疫应答。为进一步评价蛋白的免疫原性,我们利用制备的TBC1D4纯化蛋白建
ELISA法,检测了胰腺癌患者对TBC1D4的自发体液免疫应答及其频率。95例胰腺
癌患者中有20%的患者血清抗TBC1D4抗体阳性,而150例健康对照者全部为阴
性。虽然抗TBC1D4抗体阳性率不高,但假阳性率低,并且根据相关文献来看,肿瘤
抗原刺激机体体液免疫应答产生的相应抗体的阳性率普遍都不高,约为10%-
30%[4]。在Western-blot分析22例患者组织中,仅在TBC1D4蛋白上调的7例
患者中有6例抗TBC1D4抗体阳性。卡方检验显示,TBC1D4蛋白上调与抗体阳性
之间有相关性(P＜0.01)。结果提示TBC1D4蛋白上调可以在胰腺癌患者体内诱导
自发性体液免疫应答。
从总体情况来看,在蛋白水平上,TBC1B4在胰腺肿瘤细胞中表达上调,同时,过高表达
的TBC1D4蛋白又可以在胰腺癌患者体内诱导抗原特异性体液免疫应答。虽然
TBC1D4能否诱导肿瘤特异的细胞反应,还需要进一步的体外实验来验证,但体液免
疫和细胞免疫存在密切的联系,抗体的产生需要细胞和CD4+细胞的共同作用[9]。
我们的研究提示TBC1D4蛋白可能是胰腺癌免疫治疗的一个有价值的候选抗原。
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